Deciphering the defects of vesicle trafficking in RAB39B forms of Parkinson’s disease with implication in autophagy, α-Synuclein aggregation and dopaminergic presynaptic system alteration

Le proteine Rab, che lavorano come controllori essenziali della dinamica della membrana cellulare, recentemente associate a diversi percorsi patologici della malattia di Parkinson (MdP). In particolare, le varianti patogene di RAB39B causano disabilità intellettiva e MdP ad esordio precoce legato all'X con patologia cerebrale α-Sinucleina (α-Syn). In particolare, il gene RAB39B è specifico per il cervello, altamente espresso nei neuroni coinvolti principalmente nel traffico di vescicole intracellulari delle vie secretorie dell'ER-Golgi-endosoma, ma è stato scoperto che lavora nella formazione e nel mantenimento delle sinapsi. L'obiettivo generale di questo lavoro è trovare nuove intuizioni sul suo ruolo sconosciuto nella patogenesi del MdP e quale meccanismo potrebbe portare alla debolezza neuronale nel deficit autofagico di aggregati cellulari tossici e nell'alterazione dopaminergica presinaptica (DA). Al fine di identificare gli effettori RAB39B e le funzioni molecolari chiave a valle, il suo interactoma è stato identificato grazie all'implementazione del sistema di etichettatura APEX2 direttamente sulla coltura neuronale vivente. Attraverso questo approccio biochimico, stabiliamo un nuovo legame tra RAB39B e i complessi retromeri, con conseguenze funzionali sullo smistamento del carico come per M6PR, ATG9 o ATG9. Studiando i suoi interattori, ci siamo concentrati sulla funzione di traffico vescicolare e di membrana durante la formazione dell'autofagosoma nascente. Abbiamo ipotizzato che la perdita di funzione di RAB39B potrebbe portare a un difetto nella degradazione autofagica degli aggregati α-Syn nei neuroni. Sulla base di ciò, abbiamo intossicato neuroni primari di topo e neuroni RAB39B-knock out (KO) di derivazione umana con fibrille preformate α-Syn (PFF) per sottolineare la risposta del sistema autofagico, trovando alterazioni significative nei marcatori canonici LC3 e P62. Inoltre, per valutare la diffusione di α-Syn, l'aggregazione e la tipica neurodegenerazione DA, iniettiamo PFFs direttamente nel cervello dei topi RAB39b-KO. Inoltre, a causa del suo arricchimento del ruolo sinaptico, ci siamo concentrati sull'alterazione del sistema presinaptico nei topi RAB39b-KO. L'assenza di RAB39B può alterare la formazione, la funzione e il riciclo delle vescicole presinaptiche con alterazioni morfologiche e di densità delle vescicole sinaptiche, portando a una profonda riduzione del rilascio di dopamina striatale. Abbiamo trovato neurodegenerazione DA concomitante e perdita del livello di proteina VMAT2 in modo dipendente dall'età nei topi RAB39b-KO. In conclusione, i nostri risultati dimostrano una forte interazione tra la perdita di funzione di RAB39B nello sviluppo precoce del MdP con l'accumulo di α-Syn e la neurodegenerazione di DA sia in vitro che in vivo. Il nostro lavoro si concentra su associazioni prospettiche di interattori biologici, combinando dati murini e umani, fornendo una valutazione completa del fenotipo della malattia.

Rab GTPases, working as essential controllers of cellular membrane dynamics, recently associated in diverse pathological pathways of Parkinson's disease (PD). In particular, RAB39B pathogenic variants cause intellectual disability (ID) and X-linked early-onset PD with α-Synuclein (α-Syn) brain pathology. Notably, RAB39B gene is specific to the brain, highly expressed in neurons mainly involved in intracellular vesicles trafficking in the ER-Golgi-endosome secretory pathways but it was found to be work in synapse formation and maintenance. The overall objective of this work is finding new insights about its unknown role in PD pathogenesis and which mechanism could lead to neuronal weakness in autophagic deficit of toxic cellular aggregates and presynaptic dopaminergic (DA) alteration. In order to identify RAB39B effectors and downstream key molecular functions, its interactome was identified thanks to the implementation of APEX2 labelling system directly on living neuronal culture. Through this biochemical approach, we establish a novel link between RAB39B and the retromer complexes, with functional consequences on cargo sorting like for M6PR, ATG9 or ATG9. Studying its interactors, we focused on vesicular and membrane trafficking function during the formation of the nascent autophagosome. We hypothesized that RAB39B loss-of-function could lead to a defect in autophagic degradation of α-Syn aggregates in neurons. Based on that, we intoxicated mouse primary neurons and human-derived RAB39B-knock out (KO) neurons with α-Syn preformed-fibrils (PFFs) to stress the autophagic system response, finding significant alteration in LC3 and P62 canonical markers. Additionally, to evaluate α-Syn spreading, aggregation and typical DA neurodegeneration, we inject PFFs directly in RAB39b-KO mice brain. Also, due to its synaptic role enrichment, we focused on presynaptic system alteration in RAB39b-KO mice. The absence of RAB39b may alter the presynaptic vesicle formation, function and recycling with morphological and density synaptic vesicles alteration, leading to profound reduction in dopamine striatal release. We found concomitant DA neurodegeneration and loss of VMAT2 protein level in age dependent fashion in RAB39b-KO mice. In conclusion, our results demonstrate a strong interaction between RAB39B loss of function in early-onset PD development with α-Syn accumulation and DA neurodegeneration both in vitro and in vivo. Our work focus on prospectively biological interactor associations, combining mouse and human data, providing a comprehensive assessment of the disease phenotype.