An investigation on wolframin function in health and disease

La sindrome di Wolfram (WS) è una rara malattia genetica causata da mutazioni nel gene WFS1 che porta a un ampio spettro di sintomi, tra cui le più importanti sono cecità, diabete e tratti psichiatrici. WFS1 codifica per la proteina transmembrana wolframina (WFS1) che risiede nell'ER e la cui struttura e funzione sono solo parzialmente comprese, rendendo ancora incompleta la comprensione degli eventi eziopatologici alla base della sindrome. Il seguente progetto di tesi mira a decifrare meglio la funzione della wolframina in condizioni fisiologiche e patologiche. In particolare, ci siamo concentrati sullo studio delle forme sia recessive che dominanti di WS1. In primo luogo, abbiamo stabilito modelli cellulari rilevanti da campioni derivati dall'uomo per svelare i meccanismi patologici alla radice dei sintomi specifici della WS1 (PARTE I). A nostra conoscenza, questo è il primo rapporto sulla caratterizzazione neuronale specifica di pazienti. Oltre al ruolo descritto svolto dalla wolframina nel contrastare lo stress cellulare, abbiamo fatto luce su due meccanismi patologici non descritti. Il primo attribuisce alla popolazione gliale, una peculiare attività non cello-mediata che danneggia ulteriormente i neuroni già difettivi di WFS1. Questa tossicità sembra essere indotta dallo stress dell'ER che si verifica negli astrociti mutanti, che ne causa la loro attivazione e la successiva secrezione di mediatori dell'infiammazione. In questo scenario, l'utilizzo di molecole specifiche in grado di mitigare l'evento scatenante, quali chaperon chimici, ha effetti positivi sulle colture neuronali, prevenendone la morte cellulare (PARTE II e III). Inoltre, la neuroinfiammazione sembra essere un segno distintivo anche dei tessuti murini WS1, che precede la perdita delle cellule gangliari retiniche. Questa caratteristica è molto probabilmente responsabile dei primi difetti visivi osservati nei topi mutanti (PARTE IV). In secondo luogo, studi strutturali e funzionali sulle mutazioni dominanti, ci hanno permesso di identificare per la prima volta un nuovo ruolo putativo svolto da WFS1 nella regolazione dell'autofagia attraverso i suoi domini di legame LC3. I nostri risultati indicano che l'oligomerizzazione della wolframina potrebbe non essere solo un evento chiave nel suo funzionamento, ma anche la causa delle patologie dominanti, come suggerito dalla tendenza all'aggregazione dei mutanti (PARTE V). Infine, lo studio delle caratteristiche psichiatriche della WS1 in topi knock out, ha rivelato eventi neurodegenerativi e difetti comportamentali correlati alla dopamina (DA) che si verificano lungo il decorso della malattia. Le registrazioni elettrofisiologiche dei neuroni MSN che risiedono all'interno del NAc, hanno messo alla luce una loro basale propensione all'eccitabilità dovuta all'alterata capacità di queste cellule. L'alterazione della risposta suscitata dalla DA e mediata dal recettore D1R, ci ha permesso di attribuire questa sovraeccitabilità a una modulazione difettiva dei canali ionici, indicando così che la perdita di wolframina compromette la segnalazione dopaminergica (Parte VI). Nel complesso, questo lavoro fornisce una comprensione più profonda della fisiopatologia WS1, evidenziando l'importanza di caratterizzare mutazioni specifiche in contesti cellulari specifici per svelare nuovi meccanismi e possibili terapie.

Wolfram syndrome (WS) is a rare genetic disorder caused by mutations in the WFS1 gene leading to a wide spectrum of clinical dysfunctions, among which blindness, diabetes and psychiatric traits are the most prominent. WFS1 encodes for the ER-resident transmembrane protein wolframin (WFS1), whose structure and functions are only partially understood, making the comprehension of the aetiopathological events underlying the syndrome yet incomplete. The following thesis project aims at better deciphering wolframin function under physiological and pathological conditions. In particular, we focused on the study of both recessive and dominant forms of WS1. Firstly, we established relevant cellular models from human derived samples to unveil pathological mechanisms at the root of specific WS1 symptoms (PART I). Noticeably, to our knowledge this is the first report of patient’s specific neuronal characterisation. Besides the described role played by wolframin in counteracting cellular stress, we shed light on two undescribed pathological mechanisms. The first one implies glial population, which exerts a peculiar non-cell-autonomous activity further damaging WFS1 knock out neurons. This toxicity appears to be prompted by ER stress pathways occurring in mutant astrocytes, which cause their activation and subsequent secretion of inflammatory mediators. In this scenario, the use of specific molecules able to mitigate the triggering event, such as chemical chaperones, positively affecting neuronal cultures, preventing cell death (PART II and III). Besides, neuroinflammation appears to be a hallmark of WS1 murine tissues too, preceding retinal ganglion cell loss. This feature is most likely responsible for the early visual defects observed in mutant mice (PART IV). In addition, after structural and functional studies on dominant mutants, we described for the first time a new putative role played by WFS1 in autophagy regulation via its LC3 binding domains. Our findings indicate that wolframin oligomerisation might not only be a key event in its functioning, but also the cause of dominant pathology, as suggested by mutants’ aggregation tendency (PART V). Finally, the study of WS1 psychiatric features in knock out mice, uncovered DA-related neurodegenerative and behavioural defects occurring during disease. Nonetheless, electrophysiological recordings of MSNs residing within the NAc, unveiled their basal excitability propensity due to the altered capacitance of these cells. Furthermore, the impaired D1R-mediated response elicited by DA, further addressed their overexcitability to a defective channel tuning, thus implying that wolframin loss compromises dopaminergic signalling (Part VI). Overall, this work provides deeper understanding on WS1 pathophysiology, highlighting the importance of characterising specific mutations in relevant cellular settings to unveil novel pathways and possible therapies.