Investigating liver tissue dynamics to improve in vivo gene therapy

Il fegato è un importante organo bersaglio per la terapia genica in vivo, a causa del suo ruolo in diversi disordini della coagulazione e malattie metaboliche. I vettori adeno-associati (AAV) sono stati ampiamente usati per la terapia genica diretta al fegato, ottenendo significativi risultati terapeutici in diversi trial clinici. Nonostante il genoma dei vettori AAV rimane prevalentemente episomale, il transgene è mantenuto per diversi anni nel fegato adulto. Tuttavia, la proliferazione degli epatociti durante la crescita ostcola l’utilizzo dei vettori AAV in individui giovani. In passato abbiamo sviluppato vettori lentivirali (LV) che integrano il loro genoma in quello della cellula, e hanno mostrato espressione stabile in topi, cani e primati non umani adulti. Abbiamo effettuato un’analisi approfondita del mantenimento degli epatociti trasdotti con LV in seguito a crescita post-natale e omeostasi, e dell’impatto dell’età sulla terapiagenica con LV diretta al fegato nel topo. Abbiamo osservato una maggiore proliferazione degli epatociti in topi neonati, che decresce nel tempo fino, con solo il 25% degli epatociti che contribuisce alla crescita, generando la grande maggioranza del fegato adulto. Non abbiamo osservato differenze rilevanti tra la proliferazione di epatociti trasdotti e non trasdotti. Abbiamo poi osservato una maggiore efficienza di trasduzione degli epatociti in topi neonati o giovani rispetto agli adulti, in parallelo a un minor indirizzamento nelle cellule non parenchimali. Somministrando intravena (i.v.) un LV che esprime il fattore IX della coaglazione (FIX) umano abbiamo osservato la maggior produzione di FIX in topi trattai da giovani, che decresce sostanzialmente in quelli trattati dalla 4° settimana di vita. I topi neonati hanno mostrato invece un livello intermedio. I topi giovani hanno mostrato inoltre una percentuale più alta di epatociti trasdotti a multipla copia, che può contribuire alla differenza di secrezione. Abbiamo poi esaminato la distribuzione degli epatociti trasdotti nel lobulo epatico e abbiamo una preferenza di trasduzione per gli epatociti nell’area peri-centrale nei topi giovani e in quella peri-portale nei topi adulti. Queste differenze sono mantenute nel tempo, indicando che sono dovute a differenze di trasduzione e non causate da silenziamento del transgene. Abbiamo osservato che anche le cellule di Kupffer si spostano dalla zona centrale a quella portale durante la crescita, ma la loro deplezione aumenta la trasduzione della zona portale nei topi adulti, suggerendo che non determinano la distribuzine del LV nel lobulo. In conclusione, il nostro lavoro mostra che la somministrazione i.v. di LV in topi giovani porta a una maggiore trasduzione degli epatociti e secrezione del prodotto del transgene rispetto ai topi adulti, con mantenimento del transgene in seguito a proliferazione cellulare durante la crescita del fegato. Queste osservazioni forniscono informazioni sullo sviluppo della terapia genica con LV diretta al fegato verso l’applicazione in pazienti pediatrici, e gettano luce sui meccanismi di crescita post-natale del fegato nei topi, che sono rilevanti anche per strategie di modificazione sito-specifica del genoma.

The liver is a relevant target organ for in vivo gene therapy, being involved in several coagulation disorders and metabolic diseases. Adeno-associated viral (AAV) vectors have been extensively used for liver gene therapy, obtaining successful results in clinical trials. Despite AAV vector genomes remain mostly episomal, the transgene has been shown to be maintained for several years in the adult liver. However, active hepatocyte proliferation during liver growth currently challenges application of AAV-vector gene therapy to young individuals. We have previously developed lentiviral vectors (LV) that integrate their genome into host DNA and achieve stable transgene expression in adult mice, dogs, and non-human primates. Here we performed and in-depth analysis of maintenance of LV-transduced hepatocytes following post-natal liver growth and homeostasis and of the age-dependent impact on liver-directed LV gene therapy in mice. We observed a high hepatocyte proliferation rate in newborn mice that decreased over time, with only 25% of hepatocytes contributing to liver growth, generating the vast majority of the adult liver. No major differences have been observed between proliferation of LV-transduced and non-transduced hepatocytes. We then observed a higher hepatocyte transduction efficiency in young (newborn and juvenile) mice compared to adults, paralleled by a lower uptake of LV by non-parenchymal cells. By intravenously (i.v.) administering LV expressing a human coagulation factor IX (FIX) transgene we observed the highest FIX output in mice treated as juvenile, which substantially dropped when mice were treated from the 4th week of age. Newborn-treated mice showed an intermediate level of transgene output. Young mice also showed a higher percentage of multiple-transduced hepatocytes, that might contribute to the differences in transgene output. We then investigated the distribution of transduced hepatocytes in the liver lobule and observed a preferential transduction in the peri-central area in young-treated mice and in the peri-portal area in adult-treated mice. We observed that also Kupffer cells shift from the central to the portal area during growth, however their depletion did not reduce the peri-portal transduction bias in adult mice, indicating that they are not determining the LV transduction bias. Overall, our work showed that i.v. LV administration to young mice results in higher hepatocytes transduction and transgene output than in adult-treated mice, with maintenance of the transgene following cell proliferation during liver growth. These findings inform further development of liver-directed LV gene therapy towards application to pediatric patients and shed light on mechanisms of post-natal liver growth in mice, which are relevant also for genome editing strategies.