Unveiling the biological role of human circulating Hematopoietic Stem and Progenitor cells

Nonostante risiedano principalmente nel midollo osseo (BM), poche HSPC circolanti (cHSPC) ricircolano regolarmente nel sangue periferico (PB) di donatori sani in assenza di mobilizzazione. Soprattutto studi di tipo descrittivo sono stati pubblicati sino ad ora su questa rara popolazione nell’uomo e al momento manca una valutazione completa della loro composizione, caratteristiche funzionali e relazione gerarchica rispetto alle HSPC di BM. In questo studio abbiamo caratterizzato fenotipicamente la composizione delle cHSPC durante l'invecchiamento fisiologico, applicando la citometria a flusso multiparametrica su 114 campioni di PB e, come controllo, 48 campioni di BM di donatori sani (HD) di età diversa. Queste analisi sono state integrate con l’analisi del profilo trascrizionale a livello di singola cellula (scRNAseq) e studi in vitro e in vivo, al fine di studiare rispettivamente le proprietà trascrizionali e funzionali delle cHSPC in condizioni fisiologiche rispetto alla controparte di BM. Inoltre, per studiare la relazione tra HSPC circolanti e residenti nel midollo osseo e il loro potenziale di differenziamento in vivo nell'uomo, abbiamo effettuato il monitoraggio clonale dei siti d’integrazione (IS) di cHSPC, BM HSPC e cellule mature di PB isolate da pazienti trattati con terapia genica (GT) basata su HSPC. Abbiamo osservato che le cHSPC si riducono progressivamente durante l'invecchiamento e sono caratterizzate da una composizione diversa rispetto alla controparte di BM, mostrando una più alta capacità di ricircolo dei progenitori linfoidi. Le cHSPC sono in grado di differenziare nelle varie popolazioni ematopoietiche sia in vitro che in vivo, mostrando una simile capacità di migrazione nel BM ma una ridotta sopravvivenza a lungo termine dopo trapianto in topi immunodeficienti rispetto a HSPC di BM. Quest'ultima scoperta può essere spiegata dal basso contenuto di HSC primitive e da uno stato trascrizionale pre-attivato presente nelle HSC di sangue periferico in condizioni fisiologiche. Applicando scRNA-seq, abbiamo identificato un profilo trascrizionale unico nelle sottopopolazioni di cHSPC, sia primitive che più differenziate, caratterizzato da una minore attività replicativa, metabolica e trascrizionale, ma una maggiore capacità di differenziamento, adesione e risposta immunitaria rispetto alla controparte di BM. L'arricchimento dei profili fenotipici e trascrizionali di tipo linfoide osservato nelle HSPC di PB, in associazione con la loro più elevata condivisione di IS con cellule di PB di lignaggio linfoide rispetto a quello mieloide, suggeriscono che le cHSPC potrebbero seminare organi linfoidi. Inoltre, la maggiore espressione di geni di differenziamento eritroide rilevati nelle HSPC circolanti rispetto a quelle residenti è coerente con il bias di differenziamento eritroide osservato nelle cHSPC post-trapianto e nel test di differenziamento in vitro. Questi risultati suggeriscono che le cHSPC costituiscono una fonte di progenitori eritroidi, in grado di sostenere l'eritropoiesi extramidollare in risposta a stress. Infine, i nostri dati preliminari su una coorte di pazienti trattati con HSPC-GT suggeriscono che il ricircolo di HSPC può sostenere la ridistribuzione clonale di cellule staminali in siti midollari distanti, sia durante la ricostituzione ematopoietica attiva che, in misura minore, in condizioni fisiologiche. Complessivamente, i nostri risultati indicano le HSPC circolanti come una peculiare popolazione di progenitori ematopoietici in stato pre-attivato, che ricircolano continuamente tra diversi siti di midollo osseo e sono pronti per sostenere rapidamente un'attivazione e un differenziamento ematopoietico locale in situ in caso di necessità.

Although mostly resident in the bone marrow (BM), few circulating HSPC (cHSPC) regularly traffic in the peripheral blood (PB) of un-mobilized subjects. Mainly descriptive studies have been published so far about this rare population in humans, and a complete evaluation of their composition, functional features and hierarchical relationship with respect to BM HSPC is still missing. In the present study, we phenotypically characterized cHSPC composition during aging, by applying multi-parametric flow cytometry on 114 PB and, as control, 48 BM samples of healthy donors (HD) of diverse age. These analyses were integrated with single-cell transcriptome profiling (scRNAseq), and ad hoc designed in vitro and in vivo assays to investigate the transcriptional and functional properties of steady-state cHSPC with respect to BM counterpart. Moreover, to study circulating vs. resident HSPC relationships and differentiation potential in vivo in humans, we exploited integration site (IS) clonal tracking of cHSPC, BM HSPC and mature PB lineages isolated from patients treated with HSPC-gene therapy (GT). We observed that cHSPC show a progressive reduction in number during aging and a different composition than BM counterpart, with Multi Lymphoid Progenitors (MLP) displaying the highest PB circulation capability. cHSPC are endowed with multilineage differentiation potential both in vitro and in vivo, with comparable BM homing capability but reduced long-term survival after transplantation in immune-deficient mice than BM HSPC. This latter finding can be explained by the low primitive HSC content and the transcriptional pre-activated state observed in steady-state PB HSC. Indeed, applying scRNA-seq, we identified a unique transcriptional profile of both primitive and lineage-committed cHSPC subpopulations, characterized by lower replicative, metabolic and transcriptional activity, but increased differentiation-, adhesion- and immune response-priming than BM counterpart. The enrichment of lymphoid phenotypic and transcriptional signatures found in PB HSPC, together with their higher IS sharing with PB lymphoid than myeloid mature lineages suggest that cHSPC could have a role in seeding lymphoid organs. Moreover, the higher expression of erythroid marker genes detected in trafficking than resident HSPC was consistent with cHSPC erythroid differentiation bias observed after transplantation and in single-cell in vitro differentiation assay. These findings suggest cHSPC as a source of erythroid-committed progenitors, able to sustain stress-responsive extramedullary erythropoiesis. Finally, our preliminary data on a cohort of HSPC-GT patients suggest that cHSPC may sustain clonal redistribution to distant BM sites, both during active hematopoietic reconstitution and, at a lower extent, during steady-state conditions. Altogether, our findings indicate PB trafficking HSPC as a peculiar steady-state reservoir of low-cycling, pre-activated hematopoietic progenitors, which continuously recirculate among multiple BM sites and are poised for promptly sustaining activation and in situ local hematopoietic differentiation in case of demand.