A chemical screening approach targeting new autophagy modulators against ischemic brain damage

Introduzione - L’autofagia è un processo catabolico coinvolto nel mantenimento dell’omeostasi cellulare, sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Diversi studi dimostrano l’attivazione dell’autofagia nei neuroni a seguito di ischemia cerebrale. Ad oggi, il ruolo dell’attivazione dell’autofagia in contesto ischemico non è ancora stato completamente chiarito. L’identificazione di composti in grado di modulare selettivamente l’autofagia è fondamentale ai fini di proporre nuove strategie neuroprotettive e per approfondire gli esiti funzionali del processo autofagico. Materiali e Metodi - Durante il corso di Dottorato ho sviluppato una piattaforma di screening per l’identificazione di nuovi modulatori autofagici, attivi nel contesto ischemico. Grazie all’impiego di un clone cellulare esprimente la proteina LC3 (Microtubule-Associated Protein 1A/1B-Light Chain 3) marcata con pHluorin (una variante pH-sensibile della Green Fuorescent Protein), ho monitorato il flusso autofagico in una linea cellulare di neuroblastoma murino (Neuro-2a). Lo screening molecolare è stato eseguito monitorando la fluorescenza del costrutto chimerico (LC3-pHIuorin) tramite citometria a flusso semi-automatizzata. Il setting sperimentale è stato inoltre implementato esponendo le cellule a deprivazione di ossigeno e glucosio, come fattore di stress in grado di replicare parte degli eventi caratterizzanti l’ischemia cerebrale. Allo screening primario, hanno fatto seguito diversi round di validazione tramite western blot. Gli effetti delle molecole selezionate, sono stati investigati sia nella linea cellulare Neuro-2a, che in colture neuronali primarie opportunamente stimolate. Infine, ho utilizzato un modello murino di ischemia cerebrale per la validazione delle molecole che hanno fornito i risultati migliori in termini di modulazione del pathway autofagico. Risultati - Tramite uno screening preliminare in silico, abbiamo prioritizzato una libreria di 6839 composti basando l’analisi su parametri rilevanti dal punto di vista farmaceutico. Con questo approccio è stato possibile selezionare un subset di 898 molecole, utilizzate successivamente per lo screening primario in vitro. Ventisette potenziali modulatori di autofagia sono stati identificati al termine dello screening primario e, tra questi, diciannove sono stati selezionati per i successivi step di validazione. Otto delle diciannove molecole hanno superato il primo step di validazione e sono state nuovamente testate investigando la loro efficacia in esperimenti di dose-effetto. Quattro molecole sono state infine testate in condizioni di deprivazione di nutrienti in neuroni primari murini, e tre di esse sono risultate in grado di modulare efficacemente il flusso autofagico. Conclusioni - Con questo studio è stata messa a punto una strategia di screening per identificare potenziali modulatori di autofagia, adottando un processo di selezione che si caratterizza per l’applicazione di una serie di test in vitro in diversi modelli cellulari. I composti individuati come positivi ai diversi saggi, sono attualmente in fase di validazione in vivo nel modello murino di ischemia cerebrale, ai fini di completare lo studio preclinico. Questo studio permetterà di chiarire importanti aspetti del ruolo dell’autofagia nel contesto ischemico, valutandone inoltre il potenziale neuroprotettivo per future applicazioni cliniche.

Introduction - Autophagy is a self-eating process involved in the maintenance of cell homeostasis, that dominates physiological and pathological conditions. Many studies show that brain ischemia activates the autophagic flux in neurons. However, the role of such activation is far to be completely understood. The identification of selective autophagy modulators will foster the discovery of novel neuroprotective strategies, as well as gain insight into the functional outcomes of this biological process. Methods - In this study, I developed a sensitive and robust assay to explore novel autophagy modulators in brain ischemia. Using a cell clone constitutively expressing Microtubule-Associated Protein 1A/1B-Light Chain 3 (LC3) coupled with the Green Fluorescent Protein (GFP) variant pHluorin, I monitored the autophagic flux in murine neuronal cells (Neuro-2a). I performed a fluorescence-based Low Throughput Screening by semi-automated flow cytometry. I introduced in the experimental setting Oxygen-Glucose Deprivation to stress cells, mimicking the toxic environment that features the ischemic brain. Following the primary screening assay, selected molecules were further evaluated by western blot analysis on Neuro-2a and ad hoc stressed primary cortical neurons. I finally employed Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO), an experimental animal model of brain ischemia, to validate best hits. Results - We prioritized a library of 6839 bioactive compounds through an in silico screening based on physically significant descriptors and pharmaceutically relevant properties. I screened 898 compounds using the established in vitro model. The primary screening revealed 27 putative autophagy modulators. Nineteen selected compounds underwent three different validation rounds, involving an immortalized cell line and primary neuronal cultures. Eight of the nineteen molecules passed the first validation step and were further tested for their dose-response efficacy properties. Four molecules were tested on nutrient-deprived mouse cortical neurons, and three of them efficiently modulated autophagy in this model. Conclusions - I set up a platform to screen small molecules potentially modulating the autophagic process. With this screening strategy, I applied stringent-threshold in vitro tests on different cell types. Best hits are currently under in vivo evaluation using the MCAO mouse model to finalize the pre-clinical study. This study will shed light on the complexity of the autophagy flux in ischemic stroke and its neuroprotective clinical potential.