Combinatorial gene therapy for epilepsy

L'epilessia è una malattia neurologica caratterizzata da una persistente predisposizione a generare crisi, che colpisce circa l'1% della popolazione mondiale. Circa il 30% dei pazienti epilettici sono resistenti ai farmaci, quindi refrattari ai farmaci antiepilettici attualmente disponibili (AED). Meno del 10% di questi pazienti resistenti ai farmaci sono eleggibili per la chirurgia, spesso a causa di foci epilettici generalizzati o multipli, o a causa della vicinanza del focus epilettico alle aree cerebrali eloquenti. Pertanto, la terapia genica può rappresentare un approccio fattibile. Il neuropeptide Y (NPY) può agire come un anticonvulsivo endogeno. L'espressione di NPY è aumentata sia nelle sezioni ippocampali di roditori che in quelle di campioni chirurgici umani di epilessia del lobo temporale, nonostante la forte perdita di interneuroni GABAergici a livello dell’ilo. Pertanto, la terapia genica basata su NPY può rappresentare un nuovo approccio per il trattamento delle epilessie focali. Idealmente, tuttavia, tali vettori dovrebbero contenere più elementi (almeno NPY e Y2R guidati da promotori appropriati). In passato, il nostro laboratorio ha fatto grandi progressi nel campo dei vettori virali basati su HSV-1. Abbiamo quindi mirato a combinare il potenziale dei vettori HSV di ospitare DNA di grandi dimensioni, e la complessità del sistema NPY, per creare una cassetta terapeutica combinatoria "ideale". Tuttavia, le preoccupazioni residue in merito alla sicurezza della nostra nuova generazione di vettori basati su HSV-1 (chiamati J∆NI8) ci hanno spinto a valutare i profili di sicurezza ed efficacia in vitro per valutare l’effetto dell’infezione sulle proprietà elettrofisiologiche in neuroni primari. Sorprendentemente e in maniera deludente, abbiamo dimostrato che mutazioni nella glicoproteina B dell'involucro (gB), che è responsabile dell'entrata virale e della fusione cellulare, potrebbero sorgere durante la produzione del vettore virale. A livello elettrofisiologico, abbiamo inoltre visto che la gB mutata può aumentare la frequenza di potenziali d’azione e contemporaneamente ridurre sia la resistenza di ingresso che il potenziale di riposo neuroni trasdotti. Complessivamente, questi dati suggeriscono che un'attenta valutazione delle glicoproteine dell'involucro è necessaria per sviluppare vettori sicuri non replicativi basati su HSV-1 per il trattamento dei disturbi del SNC. Abbiamo quindi deciso di passare ai vettori Lentivirali (LV), una piattaforma più robusta e caratterizzata nonostante una capacità di carico più limitata rispetto ai vettori HSV. Per potenziare l'effetto protettivo di NPY, abbiamo sviluppato un approccio combinatorio di terapia genica basato sull'espressione di NPY insieme al suo recettore (Y2). Poiché i recettori Y2 agiscono principalmente a livello pre-sinaptico per diminuire il rilascio di glutammato riducendo l’ingresso di Ca2+, l'espressione dei transgeni è stata guidata dal promotore minimal CamKII, orientando così la loro espressione selettivamente nei neuroni eccitatori. Abbiamo successivamente caratterizzato la capacità dei nostri vettori LV di esprimere NPY e il suo recettore funzionale Y2 nei neuroni ippocampali e nel cervello dei topi. In seguito, abbiamo utilizzato un sistema di monitoraggio video-EEG mediante telemetria per valutare l'effetto dei geni terapeutici sul fenotipo epilettico in un modello genetico di epilessia. Abbiamo scoperto che l'espressione combinata di NPY e Y2 è sufficiente a ridurre sia la frequenza che la durata delle crisi nel modello di epilessia Synapsin triple-KO. Questi dati rafforzano ulteriormente l'ipotesi che le strategie mirate all’utilizzo di NPY e Y2 possono avere successo per il trattamento dell'epilessia, in particolare per le forme resistenti ai farmaci ma anche per forme genetiche della malattia.

Epilepsy is a neurological disease characterized by a persistent predisposition to generate seizures, that affects about 1% of the world population. About 30% of epileptic patients are drug-resistant, thus refractory to currently available anti-epileptic drugs (AEDs). Less than 10% of these drug-resistant patients are eligible for resective brain surgery, often due to generalized or multiple epileptic foci, or due to proximity of the epileptic focus to eloquent brain areas. Therefore, gene therapy may represent a doable approach for the unmet medical need of these patients. Neuropeptide Y (NPY) can act as an endogenous anticonvulsant. NPY expression is increased both in rodent and human hippocampal sections from temporal lobe epilepsy surgical samples, despite the strong loss of hilar GABAergic interneurons. Therefore, NPY-based gene therapy may represent a novel approach for the treatment of focal epilepsies. Ideally, however, such vectors should contain multiple elements (at least NPY and Y2Rs driven by appropriate promoters). In the past, great advancements in the field of viral vectors based on HSV-1 have been made by our laboratory. We therefore aimed at combining the potential of HSV vectors to accommodate large payloads with the complexity of the NPY system to create an “ideal” combinatorial therapeutic cassette. However, residual concerns on the safety and translatability of our new generation HSV-1 based vectors (named J∆NI8) let us first characterize their electrophysiological properties in primary neuronal culture, to assess both safety and efficacy profiles. Surprisingly and disappointingly, we show that mutations in the envelope glycoprotein B (gB), which is responsible for viral entry and cell fusion, might arise during viral vector production. In turn, mutated gB can increase firing frequency while reducing both input resistance and resting membrane potential of transduced neurons. Altogether, these data suggest that careful evaluation of envelope glycoproteins is needed to develop safe HSV-1 replication-defective vectors for the treatment of CNS disorders. We, therefore, decided to move to LV vectors, a more robustly characterized platform despite a more limited packaging capacity compared with HSV vectors. To potentiate the protective effect of NPY, we developed a combinatorial gene therapy approach based on the expression of NPY together with its receptor (Y2). Since Y2 receptors act mainly pre-synaptically to reduce glutamate release by lowering Ca2+ influx, transgenes expression was driven by the minimal CamKII promoter, thereby biasing their expression in excitatory neurons. We characterized the ability of our lentiviral vectors to express NPY and its functional Y2 receptor in hippocampal neurons and mouse brains. Telemetry video-EEG monitoring was then used to assess the effect of the therapeutic genes on the epileptic phenotype of a genetic mouse model of epilepsy. We found that the combined expression of NPY and Y2 is sufficient to reduce both the frequency and duration of seizures in the Synapsin triple-KO epilepsy model. These data further strengthen the hypothesis that strategies aimed at the delivery of NPY and Y2 may be successful for the treatment of epilepsy, particularly for pharmaco-resistant and genetic forms of the disease.