Axonal mRNA dysregulation in a cellular model of TDP-43 proteinopathy: a functional and -omic analysis

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa incurabile che colpisce principalmente il primo e il secondo motoneurone. Solo il 10% dei casi sono familiari, mentre la maggior parte sono sporadici. TDP-43, codificata dal gene TARDBP, è una proteina legante l’RNA che ha un ruolo regolatorio essenziale nel metabolismo dell’RNA, dalla trascrizione e splicing al trasporto e traduzione. Mentre le mutazioni di TARDBP rappresentano solo il 2-5% dei casi di SLA, il 97% dei pazienti, sia sporadici che familiari, mostrano una deplezione nucleare di TDP-43 così come il suo accumulo citoplasmatico e la formazione di aggregati, noti come TDP-43 proteinopatia. Diverse evidenze suggeriscono che la SLA sia una assonopatia distale, in cui la degenerazione assonale precede la morte del motoneurone. Poichè la traduzione assonale è essenziale per lo sviluppo, il mantenimento e il funzionamento di questo compartimento subcellulare, noi ipotizziamo che livelli alterati di mRNA dovuti alla deregolazione di TDP-43 può alterare la biologia assonale nei motoneuroni, un tipo cellulare il cui l’assone rappresenta il 99% del volume totale della cellula. In questo progetto abbiamo caratterizzato colture altamente arricchite di motoneuroni corticali murini overesprimenti TDP-43 wt (wtTDP) o con una mutazione familiare, A315T (mutTDP). Entrambi i modelli presentano un accumulo citoplasmatico di aggregati positivi per TDP-43, accompagnato da una ridotta traduzione assonale degli mRNA, aumentato stress ossidativo, alterata esocitosi e cambiamenti nell’omeostati del calcio. Mediante l’uso di camerette microfluidiche, assoni e corpi cellulari wt- e mutTDP sono stati fisicamente separati, permettendo un’analisi imparziale di RNA-seq di entrambi i compartimenti subcellulari. Mediante un protocollo con gradiente di saccarosio sviluppato dal laboratorio di Gabriella Viero, gli mRNA polisomali e sub-polisomali sono stati analizzati separatamente e comparati ai neuroni di controllo. Mi sono focalizzata sui cambiamenti del translatoma e trascrittoma relativi alle alterazioni funzionali osservati dal nostro gruppo. Sia gli assoni wtTDP che mutTDP presentano una evidente deregolazione dei trascritti polisomali coinvolti nella traduzione degli mRNA, nella risposta allo stress ossidativo e nella funzione presinaptica, sottolineando l’importanza della traduzione assonale nei processi chiave funzionali e omeostatici. Infine, le registrazioni di elettrofisiologia dei neuroni wtTDP e mutTDP hanno mostrato un aumento significativo delle sinapsi elettriche. Oltre a rappresentare potenzialmente un meccanismo di compensazione della ridotta connettività dei neuroni wtTDP e TDP-43, le gap junctions e gli emicanali, potrebbero contribuire alla diffusione di piccole molecole tossiche e una diffusione maladattiva del danno neuronale a partire dalla sua origine focale.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an incurable neurodegenerative disease that mainly affects upper and lower motor neurons. Only 10% of cases are familial, while the majority are sporadic. TDP-43, encoded by the TARDBP gene, is an RNA-binding protein that plays essential regulatory roles in RNA metabolism, from transcription and splicing to transport and translation. While TARDBP mutations are only found in 2-5% of ALS cases, 97% of patients, both sporadic and familial, show nuclear TDP-43 depletion as well as its cytoplasmic accumulation and aggregate formation, known as TDP-43 proteinopathy. Several lines of evidence suggest that ALS is a distal axonopathy in which axonal degeneration precedes motor neuron death. Since axonal translation is essential for the development, maintenance and function of this subcellular compartment, we hypothesized that altered axonal mRNA levels resulting from TDP-43 deregulation may severely affect axonal biology in motor neurons, a cell type whose axon accounts for over 99% of the total cellular volume. In this project we characterized highly enriched cultures of mouse cortical motor neurons overexpressing wt TDP-43 (wtTDP) or carrying a familial ALS mutation, A315T (mutTDP). Both models exhibit cytoplasmic accumulation of TDP-43-positive aggregates, accompanied by reduced axonal mRNA translation, increased oxidative stress, impaired exocytosis and changes in Ca2+ homeostasis. Thanks to microfluidic chambers, wt- and mutTDP axons and cell bodies were physically separated, permitting the unbiased RNA-seq analysis of both subcellular territories. Through a miniaturized sucrose gradient protocol developed by Gabriella Viero’s lab, polysome-engaged and subpolysomal mRNAs were analyzed separately in comparison to control neurons. I focused on translatome and transcriptome changes related to the functional alterations observed by our group. Both wtTDP and mutTDP axons show a marked deregulation of polysomal transcripts involved in mRNA translation, the response to oxidative stress and presynaptic function, underlining the importance of axonal translation in key functional and homeostatic processes. Finally, electrophysiological recordings of wt- and mutTDP neurons revealed a significantly increase in electrical synapses. While potentially serving as a compensatory mechanism for the reduced connectivity of wt- and mutTDP neurons, gap junctions and hemichannels may contribute to the spread of toxic small molecules and to the maladaptive dissemination of neuronal damage from its focal origin.