L’ORIGINE DELL’ETEROGENEITÀ DINAMICA DI NF-KB: DALLE CELLULE QUASI-IDENTICHE ALLA SEGNALAZIONE INFIAMMATORIA PARACRINA

Nuclear factor kappa B (NF-kB) is a master transcription factor in the cell’s response to inflammatory stimuli as it controls the expression of key chemokines and cytokines. NF-kB itself is activated by many of these molecules, largely mediated by its nuclear localization dynamics. NF-kB dynamics is fundamental for proper target gene expression, however it can also be highly heterogeneous in different cell types and even within homogeneous populations. The source of such dynamic variability is unclear. On the other hand, in a tissue paracrine signaling implies that cells receive different NF-kB activating signals depending on their position relative to the sources. The resulting NF-kB dynamic response might be also heterogeneous and yet might also carry spatiotemporal information, but this has not been properly characterized. To gain insights on the source of heterogeneity of NF-kB dynamics we isolated multiple clonal populations of a homogenous GFP-NF-kB fibroblast population and found that each has a robustly distinct NF-kB nuclear localization dynamics upon stimulation with tumor necrosis factor alpha (TNF-a). We focused on three clonal populations displaying oscillatory, persistent, and weak responses to TNF-a and found that they have small but significant differences in the expression of genes belonging to the NF-kB regulatory circuit. To characterize the heterogeneous NF-kB dynamics that might arise in paracrine inflammatory signaling, we developed in vitro sender receiver models where we can image the dynamics of NF-kB receiving signals from two senders: RAW 264.7 cells and an engineered version of our GFP-NF-kB fibroblasts that secrete TNF-a instantaneously upon induction. We found that single cells use spatiotemporal NF-kB activation to encode location and strength of the danger signals, even with a certain degree of heterogeneity. Furthermore, this spatiotemporal dynamics is shaped by an anti-priming effect due to the basal secretion of cytokines by the senders, which results in a moderate spatially-dependent population-level response to strong cytokine secretion. Overall, our results show that part of populational heterogeneity on NF-kB activation might emerge in tissue as a result of the interaction of many layers: first, due to small variations in the expression levels of genes of the NF-kB regulatory circuit between cells and second, depending on the spatiotemporal context. Our study has provided additional insights on how inflammation develops through heterogeneous dynamics of NF-kB in space and time and will potentially contribute to shed light on how complex immune responses are coordinated in healthy and pathological conditions.

Il fattore nucleare kappa B (NF-kB) è un fattore di trascrizione cruciale nella risposta della cellula agli stimoli infiammatori poiché controlla l'espressione di chemochine e citochine chiave. NF-kB stesso è attivato da molte di queste molecole, e questa attivazione è mediata in larga misura dalle sue dinamiche di localizzazione nucleare. La dinamica di NF-kB è fondamentale per la corretta espressione dei suoi geni bersaglio, tuttavia può anche essere altamente eterogenea in diversi tipi cellulari e persino all'interno di popolazioni omogenee. L’origine di tale variabilità dinamica non è chiara. D'altra parte, in un tessuto la segnalazione paracrina implica che le cellule ricevano diversi segnali che possono attivare NF-kB a seconda della loro posizione rispetto alle sorgenti. La risposta dinamica NF-kB risultante potrebbe essere eterogenea e tuttavia potrebbe anche contenere informazioni spaziotemporali, ma questa possibilità non è stata adeguatamente esplorata. Per ottenere informazioni sull’origine dell'eterogeneità delle dinamiche di NF-kB abbiamo isolato più popolazioni clonali a partire da una popolazione omogenea di fibroblasti GFP-NF-kB e abbiamo scoperto che ciascuna ha una dinamica di localizzazione nucleare di NF-kB diversa quando sono stimolate con la citochina fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-a). Ci siamo concentrati su tre popolazioni clonali che mostrano risposte oscillatorie, persistenti e deboli al TNF-a, rispettivamente, e abbiamo scoperto che hanno differenze piccole ma significative nell'espressione dei geni appartenenti al circuito regolatorio NF-kB che spiegano queste differenze dinamiche. Invece, per caratterizzare le dinamiche eterogenee di NF-kB che potrebbero insorgere nella segnalazione infiammatoria paracrina, abbiamo sviluppato modelli in vitro nei quali possiamo osservare la dinamica di NF-kB per cellule che ricevono segnali da due tipi di “mittenti”: cellule RAW 264.7 e una versione ingegnerizzata dei nostri fibroblasti GFP-NF-kB che secernono TNF-a istantaneamente dopo l'induzione. Abbiamo scoperto che le singole cellule utilizzano l'attivazione spaziotemporale di NF-kB per codificare la posizione e la forza dei segnali di pericolo, anche con un certo grado di eterogeneità. Inoltre, questa dinamica spaziotemporale è influita dal fatto che le cellule diventano meno rispondenti allo stimolo dovuto alla secrezione basale di citochine da parte dei mittenti, che si traduce in una risposta moderata a livello di popolazione che dipende dalla posizione anche in situazioni di alta secrezione di citochine infiammatorie. Nel complesso, i nostri risultati mostrano che parte dell'eterogeneità della popolazione sull'attivazione di NF-kB potrebbe emergere nei tessuti come risultato dell'interazione di diversi livelli di regolazione: in primo luogo, a causa di piccole variazioni nei livelli di espressione dei geni del circuito regolatorio di NF-kB tra le cellule e secondo, a seconda del contesto spazio-temporale. Il nostro studio ha fornito ulteriori approfondimenti su come l'infiammazione si sviluppa attraverso dinamiche eterogenee di NF-kB nello spazio e nel tempo e potenzialmente contribuirà a far luce su come le risposte immunitarie complesse sono coordinate in condizioni fisiologiche e patologiche.