WOLFRAM SYNDROME: FROM POINT MUTATION TO CELL DYSFUNCTION

La sindrome di Wolfram è una grave malattia genetica che si manifesta con diabete mellito, diabete insipido, atrofia del nervo ottico e sordità. È causato da mutazioni dominanti o recessive nel gene WFS1, che codifica per Wolframina, una proteina transmembrana implicata nella risposta allo stress del RE, nell'autofagia, nella gestione del calcio e nella secrezione insulinica. In questo studio, abbiamo indagato il caso di una paziente portatrice di nuove mutazioni in eterozigosi nel gene WFS1, con l'obiettivo di caratterizzare le componenti genetiche, molecolari e funzionali che determinano la manifestazione della patologia. Per fare ciò, abbiamo utilizzato la tecnologia delle iPSCs, riprogrammando cellule mononucleate del sangue in progenitori pluripotenti. Per quanto riguarda l’aspetto genetico, abbiamo determinato che una delle due mutazioni, situata in un sito accettore di splicing, provoca la comparsa di più isoforme alternative che risultano prive di alcune porzioni dell'mRNA originale; alcune di esse conservano il frame di lettura e generano isoforme della proteina troncate internamente. Alla luce di ciò, abbiamo corretto geneticamente tramite tecnologia CRISPR/Cas9 questo allele e ottenuto una controparte singenica. Abbiamo dimostrato che le iPSCs derivate da paziente Wolfram si differenziano nel comparto endocrino pancreatico, ma mostrano anomalie nella composizione delle sottopopolazioni endocrine e dei sottotipi di β cellule. Abbiamo studiato le alterazioni molecolari sia nelle iPSCs che nelle β cellule derivate da iPSCs: abbiamo scoperto che le β cellule hanno livelli basali alterati di risposta allo stress del RE e l'induzione dello stress esacerba ulteriormente la loro risposta anomala. Inoltre, sia le iPSCs Wolfram che le β cellule derivate da iPSCs hanno un'attivazione anormale del flusso autofagico. Sono stati condotti studi funzionali sulle β cellule, evidenziando irregolarità nei flussi di calcio e nella secrezione di insulina in risposta alla stimolazione con glucosio. Infine, tutti i meccanismi individuati concorrono a predisporre le cellule Wolfram ad andare incontro ad apoptosi in risposta a stress del RE e stimolo infiammatorio. Abbiamo dimostrato inoltre che la somministrazione di Liraglutide, un agonista del recettore GLP-1 che si è dimostrato efficace in clinica per la paziente, migliora i parametri molecolari e funzionali nelle β cellule Wolfram. In conclusione, questo studio fornisce una nuova prospettiva sulle basi molecolari di un caso particolare di sindrome di Wolfram, mettendo in connessione le mutazioni genetiche con uno schema molecolare unico e con conseguenti alterazioni funzionali.

Wolfram Syndrome 1 (WS1) is a devastating genetic disease manifesting with diabetes mellitus, diabetes insipidus, optic nerve atrophy and deafness. It is caused by dominant or recessive mutations in the WFS1 gene, coding for Wolframin, a transmembrane protein implicated in ER stress response, autophagy, Ca++ handling and insulin secretion. In the present, study, we sought to investigate the case of a patient carrying novel WFS1 heterozygous mutations, aiming to characterize the genetic, molecular and functional components that determine WS1 manifestation. To do so, we employed iPSC technology, reprogramming mononucleated blood cells into pluripotent progenitors. Concerning genetics, we determined that one of the two mutations, falling at an acceptor splice site, causes the appearance of multiple alternative isoforms lacking variable portions of the original mRNA; some of them retain the reading frame and code for internally truncated isoforms of the protein. In light of this, we genetically corrected with CRISPR/Cas9 said allele and obtained a syngeneic counterpart. We demonstrated that WS1-derived iPSCs differentiate in the endocrine lineage, but they show anomalies in the composition of the endocrine subpopulations and β cell subtypes. We investigated molecular alterations both in iPSCs and iPSC-derived β cells: we found that β cells have higher basal levels of ER stress response, and stress induction further exacerbates their anomalous response. Additionally, both WS1 iPSCs and iPSC-derived β cells have abnormal activation of the autophagic flux. Functional studies were performed on β cells, highlighting irregularities in Ca++ fluxes and insulin secretion in response to glucose stimulation. Lastly, all the individuated mechanisms concur to predispose WS1 cells to undergo apoptosis more than controls in response to ER stress and inflammatory stimuli. Of interest, we show that Liraglutide administration, a GLP-1 receptor agonist that proved effective in clinics for the patient, can ameliorate molecular and functional parameters in WS1-derived cells. In conclusion, this study provides a novel perspective on the molecular basis of a peculiar case of WS1, connecting the genetic mutations with a unique molecular signature and with downstream functional alterations.