The histone perspective: chromatin regulation of cell identity through manipulation of histone content and specific variants

Il controllo epigenetico dell'identità cellulare è un fattore chiave nella regolazione delle cellule staminali e nel modo in cui le cellule viventi possono perdere o riguadagnare la loro pluripotenza nei processi di reprogramming e differenziamento. Il ruolo delle modificazioni istoniche, degli chaperone e dei macchinari di rimodellamento della cromatina in questo contesto è ormai noto, ma l'importanza del contenuto istonico e come vari durante questi processi è molto meno studiata. Allo stesso modo, non è stata mai studiata la regolazione della trascrizione dei geni istonici. In questo lavoro, abbiamo studiato come la mancanza di HMGB1, generando un ambiente di cromatina "a bassi istonei" nelle cellule differenziate, influisca sul reprogramming e sulle iPSC. Abbiamo scoperto che le iPSC possono essere generate e autorinnovarsi in assenza di HMGB1, riducendo ulteriormente il loro contenuto di istoni. Inoltre, abbiamo analizzato come il profilo delle PTM istoniche sia alterato nelle iPSC prive di HMGB1. Infine, abbiamo osservato come la mancanza di HMGB1 non alteri l'efficienza del processo di reprogramming. Durante lo studio del reprogramming, abbiamo anche concentrato la nostra attenzione sulla trascrizione dei geni istonici, data la down-regolazione del contenuto istonico osservata durante la generazione delle iPSC. Abbiamo scoperto che la trascrizione dei geni istonici non è ridotta nelle iPSC, ma è regolata differenzialmente. In particolare, specifici geni degli istoni sono altamente up-regolati nelle iPSC. Per questo, li abbiamo chiamati "StemHistones" e abbiamo caratterizzato la funzione di tre di loro, H1f6, H2bu2 e H3f4 nelle cellule pluripotenti. Abbiamo dimostrato che sono localizzati nel nucleo e la loro down-regolazione o completa rimozione non ha un impatto sull'autorinnovamento delle mESC, ma altera l'inizio del differenziamento. Un’analisi trascrittomica ha poi rivelato come gli StemHistones siano coinvolti nella regolazione del differenziamento, poiché H1f6 impatta specificamente sull'espressione dei geni endodermici, mentre l’assenza di H2bu2 e H3f4 causa una down-regolazione dei marcatori di tutti e tre i foglietti embrionali quando viene indotto il differenziamento. In conclusione, abbiamo caratterizzato gli effetti della diminuzione degli istoni mediata da HMGB1 nel reprogramming, dimostrando che altera la cromatina delle iPSC ma non influisce sull'efficienza del reprogramming stesso. Abbiamo anche scoperto l'elevata espressione di alcuni geni istonici insoliti che abbiamo chiamato StemHistones e abbiamo individuato una loro funzione nei primi stadi del differenziamento. Pertanto, il nostro lavoro sottolinea l'importanza della quantità di proteine istoniche e della regolazione trascrizionale dei geni degli istoni come nuovi importanti fattori epigenetici nella regolazione dell'identità cellulare.

Epigenetic control of cell identity is a key factor in stem cell regulation and in how living cells can lose or re-gain their pluripotency in the processes of reprogramming and differentiation. Much is known about the role of histone marks, chaperones and remodelling machinery in this context but the importance of histone content and how it varies during these processes is much less studied. At the same time, very little is known about the regulation of histone gene transcription during cell fate transitions. Here we investigated how the lack of HMGB1, generating a “low-histone” chromatin environment in differentiated cells, impacts on reprogramming and iPSCs. We found that iPSCs can be generated and self-renew in the absence of HMGB1, while further decreasing their histone content. Furthermore, we analysed how the histone PTMs landscape is altered in iPSCs depleted of HMGB1. Eventually, we observed how the lack of HMGB1 does not alter the efficiency of the reprogramming process. As we saw a down-regulation of histone content during the road to iPSCs, we also focused our attention on transcription of histone genes. We found that histone genes transcription is not decreased in iPSCs, but to the contrary specific histone genes are highly upregulated in iPSCs. We named them “StemHistones” and characterized the function in pluripotent cells of three of them, namely H1f6, H2bu2 and H3f4. We showed that these histones are indeed chromatin-bound and that their down-regulation or complete ablation did not impact on mESCs self-renewal, but it did alter differentiation onset. Transcriptomic analysis revealed that StemHistones are involved in the regulation of differentiation, as H1f6 deletion specifically impacts on endodermal gene expression while depletion of H2bu2 or H3f4 causes downregulation of markers of all three germ layers upon differentiation. In conclusion, we characterized the effects of HMGB1-mediated histone decrease in reprogramming, showing that it alters iPSCs chromatin but does not impact on reprogramming efficiency. We also uncovered the high expression of some unusual histone genes that we named StemHistones and we linked their function to differentiation onset. Our work highlights the importance of histone protein content and histone gene transcriptional regulation as new important epigenetic layers in the control of cell identity.