UTERINE FLUID EXTRACELLULAR VESICLES AS A LIQUID BIOPSY FOR THE DIAGNOSIS OF ENDOMETRIAL RECEPTIVITY

VESCICOLE EXTRACELLULARI DA FLUIDO UTERINO COME BIOPSIA LIQUIDA PER LA DIAGNOSI DI RECETTIVITA' ENDOMETRIALE Introduzione: I tassi di impianto dopo Procreazione Medicalmente Assistita (PMA) sono subottimali a causa di fattori sia embrionari che endometriali. Se la diagnosi di euploidia embrionaria può oggi essere ottenuta grazie alle tecniche di test genetici preimpianto, la diagnosi di recettività endometriale rimane elusiva. I principali limiti degli attuali test di recettività basati sulla trascrittomica di biopsie endometriali sono: i) che non comprendono il compartimento extracellulare, il quale rappresenta un mediatore fondamentale nel cross-talk dell'impianto; ii) che in quanto invasivi non possono venire eseguiti nello stesso ciclo mestruale del tentativo di trasferimento embrionario. Scopo del progetto. Lo scopo di questo progetto è di usare le vescicole extracellulari da fluido uterino (UF-EVs) raccolto non invasivamente come una nuova fonte di marcatori trascrizionali di recettività endometriale. Metodi. Sono state incluse dapprima donne fertili volontarie, le cui UF-EVs sono state confrontate in termini di caratterizzazione fisica e analisi trascrittomica tra la fase pre-recettiva (LH+2) e la fase recettiva (LH+7) del ciclo mestruale. Quindi, è stata inclusa una prima coorte di pazienti sottoposte a PMA e una seconda coorte di validazione, composta da pazienti sottoposte a PMA e selezionata secondo criteri analoghi rispetto alla precedente. Le UF-EVs di queste pazienti sono state raccolte nella fase recettiva (LH+7) del ciclo immediatamente precedente a quello di un trasferimento di blastocisti euploide e i risultati paragonati tra pazienti con successo versus fallimento di impianto. Risultati. Il trascrittoma delle UF-EVs subisce profonde modificazioni nella fase recettiva (LH+7) rispetto a quella pre-recettiva (LH+2), con n=2247 geni differenzialmente 'espressi'. Il trascrittoma delle UF-EVs di pazienti che ottengono l'impianto di blastocisti evidenzia alcune differenze rispetto a quello di pazienti con fallimento di impianto, con n=161 geni differenzialmente 'espressi'. Le UF-EVs di pazienti con fallimento di impianto hanno anche una misura media maggiore di quelle di pazienti con impianto. Dopo aver incluso la coorte di validazione, è stata calcolata una ROC curve significativa per la predizione di impianto basata su un gruppo selezionato di geni (AUC=0.86; 95% CI 0.78-0.94, p=2.8x10-8). Nel sottogruppo di pazienti con diagnosi di fallimento ricorrente di impianto, è stato calcolato un modello two-step cluster analysis con una sensibilità pari a 94.3% e una specificità pari a 80.0% nella corretta classificazione di pazienti con successo versus fallimento di impianto. Discussione. Questi risultati supportano l'ipotesi che le UF-EVs possano essere usate per identificare un profilo trascrittomico associato a recettività endometriale nelle pazienti sottoposte a PMA. Le prospettive attuali e future saranno di validare questi risultati e di studiare la sicurezza del campionamento non invasivo di UF-EVs nello stesso ciclo mestruale del tentativo di trasferimento embrionario.

Introduction. Implantation rates in Assisted Reproduction Technologies (ART) are still suboptimal due to a contribution of both embryonic and endometrial factors. While diagnosis of embryo euploidy can be achieved through preimplantation genetic testing, the diagnosis of a receptive endometrium remains a challenge. The main limitation of current receptivity tests based on the transcriptome of endometrial biopsies are that they: i) overlook the extracellular compartment, which appears to play a major role in the implantation-related cross-talk; ii) cannot be performed in the same cycle of the embryo transfer attempt. Aim of the work. The aim of this project is to use non-invasively collected uterine-fluid derived extracellular vesicles (UF-EVs) as a novel source of transcriptomic markers of endometrial receptivity. Methods. First, fertile volunteer women were included and their UF-EVs were retrieved for physical characterization and transcriptomic analysis, both in a pre-receptive (LH+2) and receptive (LH+7) phase of the cycle. Then, a cohort of ART patients and a further analogous validation cohort were included. UF-EVs were collected during the receptive (LH+7) phase of the cycle immediately preceding that of an euploid blastocyst transfer attempt, for comparison between patients with subsequent successful versus failed implantation. Results. The transcriptome of UF-EVs markedly changes between the nonreceptive (LH+2) and receptive (LH+7) phase, with n=2247 differentially ‘expressed’ genes. The LH+7 transcriptomic content of ART patients who subsequently achieve implantation partly differs from that of patients who subsequently fail implantation, with n=161 differentially ‘expressed’ genes. UF-EVs of ART patients with failed versus successful implantation also show a higher mean size of EVs. After including the validation cohort, a significant ROC curve for prediction of implantation was calculated based on selected genes (AUC=0.86; 95% CI 0.78-0.94, p=2.8x10-8). In the subgroup of patients with a diagnosis of recurrent implantation failure, a two-step cluster analysis model could correctly classify patients as successfully or unsuccessfully treated with a test sensitivity of 94.3% and a specificity of 80.0%. Discussion. These results support the hypothesis that UF-EVs can be used to identify a transcriptomic signature of endometrial receptivity in ART patients. Current/future perspectives will be to validate these findings and to assess the safety of same-cycle, non-invasive sampling of UF-EVs prior to the embryo transfer attempt.