Improving fertility preservation strategies in women with cancer: development of a murine model of gonadotoxicity and clinical prognostic signatures of gonadal damage

La chemioterapia determina una compromissione della fertilità. Le attuali strategie di preservazione della fertilità nelle pazienti oncologiche includono la somministrazione di GnRH-a durante la chemioterapia, la criopreservazione di ovociti e di tessuto ovarico. Gli effetti della somministrazione di GnRH-a durante la chemioterapia sono stati studiati in studi pre-clinici e clinici, con risultati contrastanti. La criopreservazione ovocitaria è ad oggi una tecnica consolidata, anche se donne con diverse diagnosi mostrano risposte variabili alla stimolazione ovarica. La criopreservazione di tessuto ovarico sta emergendo quale strategia definitiva di preservazione della fertilità; tuttavia, non è chiaro se essa abbia un potenziale in donne che hanno già iniziato il trattamento antitumorale. Un nuovo campo di ricerca emergente è l’impatto, attualmente sconosciuto, che i trattamenti oncologici hanno sull’utero. Questo progetto prevede lo sviluppo di un modello murino di gonadotossicità attraverso una piattaforma di ecografia con mezzo di contrasto (CEUS) ad alta risoluzione. Abbiamo somministrato ai topi due diversi chemioterapici (doxorubicina e ciclofosfamide) allo scopo di studiare in vivo gli effetti di questi farmaci sullo sviluppo follicolare e la perfusione ovarica, con e senza l’utilizzo concomitante di analoghi del GnRH. In parallelo, abbiamo confrontato le conte follicolari delle biopsie ovariche di pazienti sottoposte alla procedura di criopreservazione di tessuto prima e dopo l’inizio della chemioterapia. Il progetto è stato implementato dall’analisi di dati clinici derivati da una popolazione di 348 pazienti valutate nel nostro ambulatorio di Oncofertilità, allo scopo di identificare fattori associati ad una ridotta fertilità, menopausa precoce e peggior risposta alla stimolazione ovarica. Infine, abbiamo sviluppato un protocollo ecografico prospettico per lo studio della morfologia e perfusione uterina dopo la chemioterapia. I nostri esperimenti su topo mostrano come il trattamento con GnRH-a non abbia inibito la follicologenesi 14 giorni dopo la somministrazione. Tuttavia, è stata osservata una riduzione della perfusione ovarica, confermata istologicamente da una riduzione dell’espressione di CD31. I topi trattati con ciclofosfamide hanno mostrato un aumento significativo di parametri quali il Peak Enhancement e il Wash-in rate, effetti ridotti dalla concomitante somministrazione di GnRH-a. I topi trattati con la doxorubicina hanno mostrato un aumento del Mean Transit Time. L’aggiunta di GnRH-a alla doxorubicina non ha alterato significativamente i parametri di perfusione. Le conte follicolari su tessuto ovarico umano hanno mostrato un numero paragonabile di follicoli primordiali tra le biopsie di donne chemiotrattate con pochi cicli e di donne non ancora chemiotrattate. L’analisi dei risultati della stimolazione ovarica controllata nelle nostre pazienti affette da tumore al seno ha mostrato lo stesso numero di ovociti maturi recuperati in caso di tumori di alto e basso stadio e di alto e basso grado; tuttavia, le donne con tumori di alto grado hanno mostrato conte follicolari ecografiche più basse e hanno necessitato di dosi più alte di gonadotropine durante la stimolazione. Le pazienti affette da sarcoma non hanno mostrato recuperi ovocitari peggiori rispetto a pazienti controllo non affette da cancro. Successivamente abbiamo sviluppato un modello prognostico per stimare la probabilità di fallimento ovarico precoce in giovani pazienti con il cancro attraverso una analisi di regressione del nostro dataset. Infine, abbiamo sviluppato un protocollo ecografico per lo studio del danno uterino da chemioterapici; i risultati preliminari hanno suggerito l’ipotesi che la chemioterapia possa determinare un aumento della resistenza delle arterie uterine.

Chemotherapy is known to determine an impairment of fertility. Current fertility preservation strategies in women with cancer include GnRH-a administration during chemotherapy, oocyte cryopreservation and ovarian tissue cryopreservation (OTC). The effects of GnRH-a administration during chemotherapy have been studied both in pre-clinical and clinical settings, with conflicting evidence. Oocyte cryopreservation is nowadays an established technique, even though women with different diagnoses of cancer can display mixed response to ovarian stimulation. OTC is emerging as the ultimate strategy for fertility preservation; however, it is unclear whether it has a potential in women who already started cancer treatment out of clinical necessity. Besides gonadotoxicity, a new emerging field of research is the impact of cancer treatments on the uterus, currently unknown. This project included the development of a murine model for the study of gonadotoxicity through a platform of high-resolution Contrast-Enhanced Ultrasound. Mice were administered 2 different chemotherapeutics (doxorubicin and cyclophosphamide) and the effects of these drugs on follicular development and perfusion were studied in vivo, with and without concurrent GnRH-a administration. In parallel, histological follicular counts of human ovarian tissue biopsies of patients undergoing OTC before and after the beginning of chemotherapy were compared. The project also developed through the analysis of clinical data from a dataset of 348 patients receiving counselling for fertility preservation at our Unit, to identify factors associated with impaired fertility and premature ovarian failure (POF), as well as poorer responses to controlled ovarian stimulation (COS). Finally, a prospective ultrasound-based protocol was developed for the study of uterine morphology and perfusion after chemotherapy in oncological patients. Results: Our murine experiments showed that GnRH-a treatment in mice did not inhibit folliculogenesis. However, it determined a decrease of ovarian perfusion, confirmed by a reduction of CD31 staining within ovarian tissue. Mice treated with cyclophosphamide had a significant increase of peak enhancement and wash-in rate, while co-administration of GnRH-a reduced this effect. Mice treated with doxorubicin showed an increase of mean transit time. Adding decapeptyl to doxorubicin did not significantly alter perfusion parameters. Follicular counts on human ovarian tissue biopsies confirmed a comparable number of primordial follicles between chemotherapy-treated and chemotherapy-naïve biopsies. The analysis of COS outcomes in our breast cancer patients cohort showed the same number of retrieved mature oocytes in high-stage and low-stage cancers, as well as high-grade and low-grade cancers, however women with high-grade breast cancer showed lower antral follicular counts and required higher doses of gonadotropins during stimulation. Patients diagnosed with a sarcoma did not show worse COS outcomes compared with a cohort of controls without a cancer diagnosis. Next, a prognostic model to assess the probability of POF in young women with cancer was developed from a regression analysis of dataset. Finally, the ultrasound protocol for the study chemotherapy-related uterine changes was developed and the first preliminary results generated the hypothesis that chemotherapy could determine an increase of uterine artery resistance. Currently, the best outcomes for fertility preservation can only result by an individualized approach and a combination of different strategies, before or right after the beginning of treatments. Gonadal protection could be different depending on each drug used. The damage could not be limited to the gonads, but also involve the uterus: further studies are urgently needed to develop protective strategies on this front. At the current state of knowledge, GnRH may be offered in addition, and not instead of other strategies.