Svilluppo di un nuovo sistema di drug screening cellulare e molecolare per il trattamento della sindrome di Rett

Abstract Rett syndrome (RTT) is a devastating neurodevelopmental disorder caused by mutations in the X-linked MECP2 gene, primarily acting as transcriptional repressor. Although RTT proved to be reversible in mice, no cure is yet available. Several Mecp2-muntant mouse models have been developed and they generally reproduce behavioral and physiological phenotypes observed in RTT patients, establishing that disease phenotypes are widely due to neuronal dysfunctions. However, their use in large drug screening programs require a great number of animals, elevated costs and time-consuming experimental approaches. To support the in vivo evaluation, new drug screening systems have emerged in vitro, usually based on the analysis of neuronal defective morphology. We previously demonstrated that the amelioration of the transcriptional profile in Mecp2-null neurons appears as a better indicator of functional rescue than morphological readouts. For this reason, we aimed at developing a cell-based drug screening system for RTT therapy, based on customized high-throughput 96x96 qRT-PCR arrays. To this purpose, a longitudinal RNASeq analysis performed in differentiating Mecp2-null neuronal precursors cells identified consistent transcriptional defects of RTT neurons. By using different prioritization criteria and testing selected neuronal differentially expressed genes (DEGs) on 96x96 qRT-PCR cards, we established a group of reproducible DEGs which represent our quantitative probes to measure the transcriptional amelioration induced by the drugs tested. To assess whether the selected DEGs are able to reflect the efficacy of drugs in vivo, we analyzed the effects of the ampakine CX546, for which we previously published positive results in vitro and in vivo. The drug demonstrated to rescue 75% of our selected DEGs, though a sample size larger than expected was required to reproduce RNASeq data in qRT-PCR experiments, forcing us to reconsider its use for the screening of large drug libraries in a laboratory scale. Thus, we propose the use of our screening system as either a confirmatory approach of a previously produced selection of molecules or as a useful system to validate rationally deduced pharmacological approaches. As secondary outcome, we identified and further characterized a consistent defect in the expression of two genes, Haus7 and Nsdhl, in cultured neurons and Mecp2-defective tissues, prompting further investigations of their role and functions in RTT pathogenesis. A comprehensive analysis of their expression across different stages and models of the disorder lay the foundation for novel possible pathogenic mechanisms of RTT and hopefully will provide new potential targets for RTT therapy.

La sindrome di Rett è una grave malattia del neurosviluppo, causata da mutazioni del gene MECP2 presente nel cromosoma X, che agisce principalmente come repressore trascrizionale. Nonostante la Rett si sia dimostrata reversibile nel topo, non è ancora disponibile una cura per questa devastante patologia. Negli ultimi vent’anni sono stati sviluppati numerosi modelli animali mutati in grado di riprodurre i classici segni della patologia e i difetti molecolari osservati nei pazienti, contribuendo alla scoperta che il fenotipo patologico è principalmente causato dalla mancanza di MeCP2 a livello centrale. Tuttavia, l’uso di questi modelli per testare librerie di farmaci richiederebbe dei costi elevati e lunghe tempistiche sperimentali. Pertanto, per supportare e accelerare gli screening farmacologici in vivo, sono stati sviluppati nuovi sistemi di screening in vitro, basati sulla valutazione degli effetti del farmaco sulla morfologia neuronale, che solitamente è difettiva nei pazienti affetti da sindrome di Rett. Tuttavia, il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che il recupero dei difetti trascrizionali tipici della malattis assicurano un maggiore miglioramento funzionale dei neuroni rispetto a quello causato dal recupero dei difetti morfologici. Sulla base di questi nostri dati preliminari, il mio progetto di dottorato prevedeva lo sviluppo di un nuovo sistema di drug screening in vitro, basato sulla valutazione del recupero trascrizionale indotto da diversi trattamenti farmacologici, utilizzando piastre high-throughput 96x96 di RT-qPCR. Per sviluppare questa nuova piattaforma trascrizionale, abbiamo eseguito un’analisi di trascrittomica longitudinale su colture in differenziamento di precursori neuronali privi di Mecp2, identificando dei difetti trascrizionali tipici dei neuroni Rett. In seguito ad un processo di prioritizzazione e selezione dei geni deregolati, abbiamo validato un gruppo di geni in diverse piastre 96x96 di RT-qPCR e abbiamo in questo modo identificato un gruppo di geni deregolati in modo consistente da usare come readout per misurare l’efficacia farmacologica. Per stabilire se questi geni potessero realmente riflettere la potenziale efficacia di un farmaco in vivo, abbiamo testato la capacità di recuperare l’espressione dei geni difettivi in seguito al trattamento con l’ampachina CX546, per la quale avevamo precedentemente dimostrato un’efficacia in vitro e nel modello murino nullo. I neuroni trattati con CX546 hanno dimostrato un miglioramento trascrizionale del 75% dei geni difettivi testati, anche se negli esperimenti di RT-qPCR abbiamo dovuto aumentare il numero di campioni necessari a riprodurre i dati trascrizionali di trascrittomica. Per questo motivo proponiamo il nostro sistema di screening farmacologico come un approccio di conferma di molecole già precedentemente selezionate da uno screening morfologico in vitro oppure per scegliere un potenziale candidato farmaco tra alcuni scelti sulla base delle loro funzioni farmacologiche. In parallelo, i dati di trascrittomica ci hanno permesso di identificare e di caratterizzare due geni consistentemente deregolati, Haus7 e Nsdhl, in colture cellulari e tessuti cerebrali privi di Mecp2, dimostrando un loro possibile coinvolgimento nella patogenesi della malattia e offrendo dei nuovi possibili target terapeutici per la sindrome di Rett.