N-glycosylation inhibition hinders immunosuppressive tumor microenvironment cells improving CAR T cell efficacy

La terapia CAR-T ha dimostrato impressionanti risultati verso tumori delle cellule B, ma ancora una ridotta efficacia contro i tumori solidi. In questo contesto, diversi ostacoli devono essere superati, tra cui un ridotto riconoscimento del tumore e la presenza di un microambiente tumorale (TME) fortemente immunosoppressivo. La nostra Unità ha recentemente dimostrato che l’inibizione farmacologica della sintesi di N-glicani nelle cellule tumorali aumenta l’efficacia della terapia CAR-T, migliorando il riconoscimento del tumore e prevenendo l’esaurimento delle cellule T. In questo progetto, abbiamo indagato il ruolo del blocco dell’N-glicosilazione sulle cellule del TME nel contesto di metastasi epatiche derivate da tumore al colon (CRC) e al pancreas (PDAC) mediante CAR-T specifici verso l’antigene CEA.Con questo scopo, abbiamo eseguito delle co-colture tripartite e saggi di soppressione includendo macrofagi M2 (M2-M) e cellule stellate del fegato (HepSCs) trattati con agenti de-glicosilanti. Questi studi hanno dimostrato che l’inibizione della N-glicosilazione annulla l’abilità di entrambe le cellule del TME di bloccare la proliferazione delle cellule T e aumenta l’uccisione delle linee tumorali (BxPC3 e LoVo) e degli organoidi derivati da tumore di paziente (PDOs da metastasi epatiche derivate da CRC). Questi effetti sono associati a un profondo cambiamento fenotipico e trascrizionale in M2-M e in HepSCs. In particolare, il trattamento è in grado di inibire la polarizzazione dei macrofagi M2 in termine di markers di espressione, secrezione di IL-10 e profilo di espressione genica, ed è in grado di inibire l’attivazione delle stellate epatiche e l’asse PD-1/PDL-1. Per valutare l’effetto del blocco della N-glicosilazione sulle cellule del TME in vivo, abbiamo utilizzato topi immunodeficienti ricostituiti con il sistema immunitario umano (huSGM3), in cui sia cellule tumorali che PDOs sono stati infusi nel fegato e i topi sono stati trattati con anti-CEA CAR-T. In questo modello, la presenza del sistema immunitario umano supporta la risposta CAR-T e aiuta a ricreare un microambiente tumorale umano, rappresentativo delle patologie umane. Inoltre, in questi topi abbiamo osservato che l’inibizione dell’N-glicosilazione aumenta l’attività anti tumorale delle cellule CAR-T anti-CEA e questo è associato con la ridotta espressione di geni immunosoppressivi nelle cellule immunitarie umane infiltranti il tumore. In conclusione, questi dati suggeriscono che il blocco della N-glicosilazione può aiutare a superare diverse barriere che limitano l’efficacia della terapia CAR-T nei tumori solidi, agendo non solo sulle cellule tumorali, ma anche sulle cellule immunosoppressive del microambiente tumorale.

Adoptive transfer of CAR T cells demonstrated impressive results against B-cell malignancies, but still limited efficacy against solid tumors. In this context, multiple challenges need to be overcome, including poor tumor recognition and strong immunosuppression within the tumor microenvironment (TME). Our Unit has recently reported that pharmacological inhibition of N-glycan synthesis in cancer cells increases CAR T cell efficacy by improving tumor recognition and preventing T cell exhaustion. In this project, we investigated the role of N-glycosylation blockade on TME cells in the context of colorectal cancer (CRC) and pancreatic adenocarcinoma (PDAC)-derived liver metastases and CEA-specific CAR T cell therapy. To this aim, we performed tripartite co-cultures and suppressive assays including M2 macrophages (M2-M) and hepatic stellate cells (HepSCs) treated with de-glycosylating agents. These studies revealed that N-glycosylation inhibition abolishes the ability of both TME cells to restrain T cell proliferation and increases the elimination of cancer cell lines (BxPC3 and LoVo) and patient-derived tumor organoids (PDOs from CRC-liver metastases). Interestingly, these effects were associated with profound phenotypic and transcriptional changes in M2-M and HepSCs. In particular, the treatment was able to inhibit M2-polarization in terms of surface markers expression, IL-10 secretion and gene expression profile, and was shown to hinder the activation of HepSCs and inhibit the PD- 1/PDL-1 axis. To evaluate the effect of N-glycosylation blockade on TME cells in vivo, we exploited immunodeficient mice reconstituted with a human immune system (huSGM3), engrafted intra-hepatically with tumor cells (either BxPC3, LoVo or PDOs) and treated with CEA CAR T cells. In this model, the presence of human immune cells supports CAR T cell responses and helps recreate an immune TME more representative of the human disease. Importantly, using these mice we observed that N-glycosylation inhibition increases CEA CAR T cell antitumor activity and this is associated with the downregulation of immunosuppressive genes in tumor-infiltrating human immune cells. Overall, these data suggest that blocking N-glycosylation can help overcome multiple barriers that currently limit CAR T cell efficacy in solid tumors, acting not only on tumor cells, but also on immunosuppressive tumor microenvironment cells.