EVENTI PATOGENETICI CHE PORTANO AL DANNO RENALE TUBULO-INTERSTIZIALE NELLA MALATTIA RENALE ASSOCIATA A MUTAZIONI DI UROMODULINA

Tubulointerstitial Kidney Disease (ADTKD-UMOD), a rare cause of end-stage kidney disease, characterized by interstitial fibrosis and inflammation. The hallmark of UMOD mutations is endoplasmic reticulum (ER) retention of misfolded uromodulin, but downstream molecular mechanisms of pathogenesis are still unclear, and no therapeutic strategy is currently available. In a mouse model expressing C147W mutant uromodulin (TgUmodC147W) and modelling human disease, we reported induction of pro-inflammatory chemokines already at one day-post natal, in absence of any histological sign of kidney damage. Since all up-regulated chemokines are ligands of the same receptor Ccr2, we generated a TgUmodC147W/Ccr2-/- mouse line to evaluate the role of Ccr2 axis in disease onset and progression. TgUmodC147W/Ccr2-/- mice were characterized at different stages of disease. Our results showed that targeting of Ccr2 does not block disease onset nor it delays disease progression, as no significant differences were detected between TgUmodC147W mice carrying Ccr2-/- or Ccr2+/+ genotype. Stemming from the serendipitous observation of full rescue of mutant uromodulin ER retention in a TgUmodC147W mouse which showed at sacrifice low body weight and malocclusion due to incisors overgrowth, we hypothesized that such effect was due to reduced food intake. A proof-of-concept experiment of calorie restriction (CR) regimen, mimicking food intake reduction, indeed recapitulated the effect on mutant uromodulin trafficking observed in the “rescued” mouse. To assess the therapeutic potential of reducing the intracellular load of mutant uromodulin, we tested the effect of a milder and prolonged CR protocol. Also this milder protocol led to a drastic reduction of mutant uromodulin ER retention and aggregation in epithelial expressing cells. Our data point at restored autophagic flux and consequent degradation of mutant uromodulin intracellular aggregates as a mechanism of action of CR. This, in turn, relieves cell stress and downstream activation of inflammation and fibrosis, ameliorating disease phenotype of TgUmodC147W mice. Overall, our results establish the proof of principle that rescuing the primary effect of UMOD mutations can prevent ADTKD-UMOD onset and progression and provide evidence for a possible therapeutic strategy.

Mutazioni nel gene UMOD, codificante uromodulina, determinano l’insorgenza della malattia renale tubulointerstiziale autosomica dominante (ADTKD-UMOD), una causa rara di insufficienza renale terminale caratterizzata da fibrosi interstiziale ed infiammazione. Il segno distintivo delle mutazioni in UMOD è la ritenzione di uromodulina mutata nel reticolo endoplasmatico (RE). Tuttavia, i meccanismi molecolari di patogenesi non sono ancora stati chiariti e ad oggi non sono disponibili terapie specifiche. In un modello murino esprimente uromodulina con la mutazione C147W (TgUmodC147W) e che ricapitola le principali caratteristiche della malattia umana, abbiamo osservato l’induzione di chemochine pro-infiammatorie già ad un giorno di età, in assenza di segni istologici di danno renale. Tutte le chemochine sovra-espresse sono ligandi dello stesso recettore, Ccr2. Abbiamo quindi generato una linea murina TgUmodC147W/Ccr2-/- per valutare il ruolo della via di segnalazione attivata da Ccr2 nell’insorgenza e nella progressione della malattia. A tale scopo, i topi TgUmodC147W/Ccr2-/- sono stati caratterizzati a diverse età, corrispondenti a diversi stadi della malattia. I nostri risultati hanno dimostrato che l’assenza di Ccr2 non blocca l’insorgenza della malattia né ne ritarda la progressione, in quanto non abbiamo osservato differenze significative tra i topi TgUmodC147W con genotipo Ccr2-/- o Ccr2+/+. Partendo dall’osservazione della quasi completa riduzione della ritenzione di uromodulina mutata nel RE in un topo TgUmodC147W, che al momento del sacrificio aveva un peso corporeo molto inferiore rispetto agli altri animali e presentava problemi di mal occlusione dentale, abbiamo ipotizzato che l’effetto osservato fosse dovuto ad una ridotta nutrizione. Per testare questa ipotesi abbiamo eseguito un esperimento preliminare di restrizione calorica (RC) per mimare la ridotta assunzione di cibo. Questo esperimento ha confermato la nostra ipotesi, ricapitolando l’effetto sulla ritenzione nel RE e sulla maturazione di uromodulina mutata. Per valutare l’efficacia terapeutica della riduzione dell’accumulo intracellulare di uromodulina mutata abbiamo testato l’effetto di un protocollo di RC più blando e prolungato. Anche questo protocollo ha portato ad una drastica riduzione della ritenzione nel RE e della aggregazione di uromodulina mutata nelle cellule epiteliali esprimenti. I nostri dati indicano che la RC agisce ripristinando il flusso autofagico con conseguente degradazione degli aggregati intracellulari di uromodulina mutata. Questo, a sua volta, allevia lo stress cellulare e l’attivazione a valle dell’infiammazione e della fibrosi, migliorando la funzionalità renale ed il fenotipo malattia nei topi TgUmodC147W. Nel complesso, i risultati riportati in questa tesi stabiliscono la prova di principio che la correzione dell’effetto primario delle mutazioni in UMOD può prevenire l’insorgenza e la progressione di ADTKD-UMOD, ponendo le basi per una possibile strategia terapeutica.