Unraveling the physiopathological role of sacsin, the protein mutated in autosomal recessive spastic ataxia of Charlevoix–Saguenay (ARSACS)

L'atassia spastica recessiva autosomica di Charlevoix-Saguenay (ARSACS) è un disturbo neurodegenerativo causato da mutazioni di perdita di funzione nel gene SACS che codifica per sacsina, una proteina multimodulare di 520 kDa il cui ruolo è poco compreso. ARSACS si caratterizza per un'insorgenza precoce dell'atassia cerebellare, seguita da spasticità e neuropatia sensomotoria. I pazienti con ARSACS e il modello di topo Sacs-/- mostrano una perdita selettiva di neuroni di Purkinje (PNs) nei lobuli anteriori. I pazienti con ARSACS presentano una variabilità fenotipica intra- e interfamiliare, senza una chiara correlazione genotipo-fenotipo. Al momento non esistono trattamenti disponibili né sono in corso trial clinici. Sacsina è espressa nel sistema nervoso centrale (SNC) con i livelli più alti nei neuroni di Purkinje nel cervelletto. L'ARSACS è caratterizzata da un insolito impacchettamento anomalo di neurofilamenti riportato sia nell'autopsia del cervello di pazienti ARSACS che nelle sezioni di cervello di topi Sacs-/-. Un'altra caratteristica citopatologica riportata in modelli cellulari di ARSACS è l'alterazione della morfologia e del metabolismo mitocondriale. Tuttavia, il legame meccanicistico tra la funzione di sacsina e le alterazioni di neurofilamenti, e la connessione tra le alterazioni mitocondriali e i neurofilamenti con la degenerazione dei neuroni di Purkinje non sono stati valutati a fondo, rallentando anche gli approcci terapeutici. Valutando il livello e il turnover di sacsina in un pannello di cellule di pazienti ARSACS con diverse mutazioni, abbiamo fornito prove che sacsina è sempre assente o sensibilmente ridotta indipendentemente dalla natura della mutazione nel gene SACS. Per le mutazioni missense di SACS, che sono la maggioranza, abbiamo dimostrato che ciò è dovuto alla degradazione precoce cotraduzionale delle catene nascenti di sacsina. Questo meccanismo è stato osservato per la prima volta come causa di una malattia umana e spiega la mancanza di correlazione genotipo-fenotipo in ARSACS. Inoltre, documentiamo qui una fosforilazione insufficiente alle code C-terminali dei neurofilamenti che causa un maggior compattamento delle fibre di neurofilamenti nel cervelletto dei topi Sacs-/-. Questo è il primo evento molecolare della malattia, il quale causa un alterato trasporto di organelli nei neuroni di Purkinje. Ho quantificato e valutato questo fenotipo sia in neuroni di Purkinje Sacs-/- che in cellule SH-SY5Y SACS-/-. Capire la patologia molecolare d ARSACS ha reso possibile razionalizzare un approccio di terapia genica. Ho valutato un versione miniaturizzata di sacsin (minisacsin) adatta per il trasferimento genico mediato da vettori virali adenoassociati. Usando il compattamento di neurofilamenti come parametro, ho dimostrato che minisacsin non è tossica ed è funzionale.

Autosomal recessive spastic ataxia of Charlevoix-Saguenay (ARSACS) is a neurodegenerative disorder caused by loss-of-functions mutations in the SACS gene encoding for sacsin, a 520 kDa multimodular protein whose function is poorly understood. ARSACS is characterized by early onset cerebellar ataxia, followed by spasticity and sensorimotor neuropathy. ARSACS patients and the Sacs-/- mouse model show selective loss of Purkinje neurons (PNs) in anterior lobules. ARSACS patients shows intra- and interfamilial phenotypic variability, with no clear genotype-phenotype correlation. There are currently no treatments available, nor are clinical trials ongoing. Sacsin is expressed in the central nervous system (CNS) with the highest levels in PNs in the cerebellum. ARSACS is characterized by a peculiar abnormal bundling of neurofilaments (NFs) reported both in ARSACS patients’ brain autopsies and Sacs-/- mouse brain sections. Other cytopathological hallmarks reported in cellular models of ARSACS were mitochondrial morphology and metabolism impairment. However, the mechanistic link between sacsin function and NFs alterations, and the connection between the mitochondrial alterations, NFs bundling and PNs degeneration, were not deeply assessed, hindering also therapeutic approaches. By assessing sacsin level and turnover in a panel of ARSACS patients’ cells with different mutations, we provided evidence that sacsin is always absent or strikingly reduced regardless of the nature of the SACS mutation. For SACS missense mutations, which are the vast majority in ARSACS patients, we demonstrated that this is due to preemptive cotranslational degradation of sacsin nascent chains. This mechanism has been observed for the first time as the cause of a human disease and explains lack of genotype-phenotype correlation in ARSACS. Moreover, we document here an insufficient phosphorylation at the C-tail of NFs subunits that results in more compact NFs fibers in Sacs-/- mouse cerebellum. This is an early event in the disease, which causes impairment of organellar trafficking in PNs. I carefully assessed and quantified this phenotype in primary Sacs-/- PNs and in cellular models (SACS-/- SH-SY5Y cells by CRISPR/Cas9). Understanding of ARSACS molecular pathology rationalized gene therapy to target NFs bundling. I assessed an engineered miniaturized version of sacsin (minisacsin) suitable for AdenoAssociated Viral (AAV) mediated gene transfer. Using NFs bundling phenotype as a quantitative imaging readout, I have finally demonstrated that minisacsin is not toxic and functional and is able to counteract NFs bundling both in SACS-/- SH-SY5Y cells and in Sacs-/- PNs, paving the way for a preclinical trial in vivo.