ERC1-CONTROLLED PROTEIN CONDENSATES TO REGULATE CELL MIGRATION AND INVASION

La migrazione cellulare è orchestrata da intricate reti molecolari che coordinano l'adesione e i riarrangiamenti citoscheletrici per facilitare la protrusione del fronte cellulare. Il nostro laboratorio ha precedentemente identificato una rete proteica necessaria per l'assemblaggio di piattaforme dinamiche associate alle membrane plasmatiche (PMAP). Questa rete comprende le proteine scaffold ERC1/ELKS, Liprin-α1 e LL5, importanti per promuovere la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. La natura dinamica di questa rete e la mancanza di membrane rilevabili ha portato all'ipotesi che l'assemblaggio delle PMAPs sia guidato da interazioni intermolecolari che innescano la separazione di fase liquido-liquido (LLPS). A sostegno di questa ipotesi, abbiamo precedentemente scoperto che ERC1 forma condensati biomolecolari citoplasmatici (BCs) con un comportamento simile a quello di un liquido che è coerente con LLPS (Sala et al., 2019). Lo scopo del mio progetto di dottorato è stato quello di indagare alcuni dei meccanismi molecolari coinvolti nella formazione di PMAP funzionali mediata da ERC1. In primo luogo, ho identificato ERC1(270-370) e LL5β(381-510) come frammenti minimi necessari per l'interazione diretta tra le due proteine. La caratterizzazione biochimica e gli esperimenti NMR confermano la loro forte interazione intermolecolare. Saggi di motilità cellulare hanno rivelato che l'espressione di frammenti specifici interrompe la formazione di PMAPs e influisce sulla motilità e sull'invasione delle cellule tumorali. Ho poi studiato il ruolo della regione N- terminale di ERC1 nel guidare la LLPS. Ho identificato ERC1(1-244) come una regione sufficiente a guidare LLPS in vitro e nelle cellule. Il recupero della fluorescenza dopo fotobleaching (FRAP) ha confermato il comportamento liquido dei BC ERC1(1-244). La delezione di questa regione N-terminale di ERC1 ha alterato significativamente la LLPS di ERC1, senza influenzare le sue interazioni con i partner PMAP Liprin- α1 e LL5. Ho scoperto che ERC1D262 compromette le capacità di migrazione e invasione delle cellule di cancro al seno. Questi risultati evidenziano l'importanza di ERC1 nell'assemblaggio di PMAP funzionali, che si basa sia su interazioni eterotipiche ERC1-LL5b ad alta affinità, sia su interazioni omofile (probabilmente deboli) ERC1-ERC1. I risultati suggeriscono che la perturbazione di uno dei due tipi di interazione può interferire con la formazione delle PMAP e con la loro funzione nella migrazione e nell'invasione delle cellule tumorali.

Cell migration is orchestrated by intricate molecular networks that coordinate adhesion and cytoskeletal rearrangements to facilitate protrusion at the cell front. Our lab previously identified a protein network required for the assembly of dynamic plasma membrane-associated platforms (PMAPs). This network includes the scaffold proteins ERC1/ELKS, Liprin-α1 and LL5 that are important in promoting cell migration and invasion of tumor cells. The dynamic nature of this network and the lack of detectable membranes has led to the hypothesis that the assembly of PMAPs is driven by intermolecular interactions triggering liquid-liquid phase separation (LLPS). In support of this hypothesis, we previously found that ERC1 forms cytoplasmic biomolecular condensates (BCs) with a liquid-like behavior that is consistent with LLPS (Sala et al., 2019). The aim of my PhD project has been to investigate some of the molecular mechanisms involved in ERC1-mediated formation of functional PMAPs. First, I identified ERC1(270–370) and LL5β(381–510) as minimal fragments required for the direct interaction between the two proteins. Biochemical characterization and NMR experiments confirm their strong intermolecular interaction. Cell motility assays revealed that the expression of specific fragments disrupts the formation of PMAPs and affects tumor cell motility and invasion. Next, I investigated the role of the N-terminal region of ERC1 in driving LLPS. I identified ERC1(1-244) as a region sufficient to drive LLPS in vitro and in cells. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) confirmed the liquid behavior of ERC1(1-244) BCs. Deletion of this N-terminal region of ERC1 significantly altered ERC1 LLPS, without affecting its interactions with the PMAP partners Liprin-a1 and LL5. I found that ERC1D262 impairs the migration and invasion capacities of breast cancer cells. These findings highlight the importance of ERC1 in the assembly of functional PMAPs, that relies both on heterotypic ERC1-LL5b high affinity interactions, as well as on homophilic (likely weak) ERC1-ERC1 interactions. The results suggest that perturbing either type of interaction can interfere with the formation of PMAPs, and with their function in tumor cell migration and invasion.