Combining new mouse models with single cell imaging and genomic technologies to study COVID-19 virology, immunopathogenesis and coagulopathy

Background. La recente generazione di vaccini COVID-19 efficaci ha ridotto la morbilità e la mortalità causate da SARS-CoV-2. Tuttavia, l'emergere di nuove varianti che possono sfuggire all'attività neutralizzante degli anticorpi specifici del virus minaccia la loro efficacia. Per questo motivo, è necessario uno studio approfondito sui determinanti immunitari che conferiscono una protezione di memoria, non basata solo sull'immunità umorale, ma anche su quella cellulare. Per colmare questa lacuna, (I-II) abbiamo cercato di stabilire un sistema di infezione da SARS-CoV-2 migliorato in modelli preclinici, che imitasse da vicino il tropismo virale e i sintomi della COVID-19. (III) Poi, sfruttando questo nuovo sistema, abbiamo caratterizzato un nuovo modello di topo ibrido transgenico minimamente modificato con ACE2 umano (hy-ACE2). (IV) Infine, abbiamo utilizzato questi nuovi strumenti per studiare la risposta indipendente dagli anticorpi contro l'infezione secondaria da SARS-CoV-2. Materiali e metodi: (I-II) Abbiamo infettato topi transgenici K18-hACE2, disponibili in commercio, che esprimono l'enzima di conversione dell'angiotensina umano 2 sotto il promotore della citocheratina 18, utilizzando il nostro nuovo sistema di infezione per aerosol (AR) e confrontandolo con l'iniezione intranasale (IN). Abbiamo valutato la replicazione del SARS-CoV-2 nel sistema nervoso centrale e nelle vie respiratorie e lo sviluppo di sintomi respiratori. (III) Inoltre, abbiamo esposto topi transgenici hy-ACE2 con AR-SARS-CoV-2 e abbiamo esaminato la conseguente replicazione virale, le caratteristiche cliniche e le risposte immunitarie antivirali. (IV) Abbiamo utilizzato topi DHLMP2a, privi di immunoglobuline di superficie e circolanti, e li abbiamo incrociati con topi K18-hACE2 e hy-ACE2 per studiare le risposte anticorpali indipendenti all'infezione secondaria da SARS-CoV-2. Risultati: (I-II) L'infezione IN ha provocato un'encefalite fatale, che si verifica raramente nei pazienti con COVID-19, limitando l'utilità di questo modello. D'altra parte, i topi esposti all'aerosol di SARS-COV-2 sono sopravvissuti e hanno sviluppato una memoria di risposta immunologica nel tempo. Analogamente ai topi infettati da IN, i topi K18-hACE2 infettati da AR hanno sviluppato malattia polmonare e anosmia. Tuttavia, l'esposizione all'AR della SARS-CoV-2 ha indotto un aumento della risposta immunitaria specifica per il virus e la deposizione di fibrina nel polmone. (III) I topi Hy-ACE2 hanno mostrato un livello fisiologico di espressione dell'ACE2 pur sostenendo la replicazione della SARS-CoV-2 in vivo. Inoltre, questi topi hanno sviluppato una malattia polmonare e una risposta immunitaria specifica per il virus. (IV) Sia i topi anticorpo-competenti che quelli carenti esposti alle varianti D614G/Delta del SARS-CoV-2 o immunizzati per via intramuscolare con SARS-CoV-2 (Wuhan-Hu-1) modificato con nucleoside e nanoparticelle lipidiche (LNP) sono stati protetti in caso di infezione eterologa con la variante Omicron B1 del SARS-CoV-2. Inoltre, sia i topi anticorpo-competenti che quelli carenti sono stati protetti dalla COVID-19 grave indotta da un'infezione ad alte dosi con il SARS-CoV-2 adattato ai topi. Infine, depletando le cellule T CD4+ e/o CD8+ in vivo, abbiamo osservato un ruolo potenziale delle cellule T CD4+ nella protezione contro il re-challenge di SARS-CoV-2 eterologo. Conclusioni. Nel complesso, questi risultati sottolineano (I-II) lo sviluppo di un nuovo sistema di infezione da SARS-CoV-2 basato sull'aerosol, che ha ben riprodotto le caratteristiche cliniche e la risposta immunitaria di COVID-19 sia nei topi transgenici K18-hACE2 sia (III) nei nostri nuovi modelli di topo hybrid umano/mouse ACE2. (IV) Questi nuovi strumenti sono stati utilizzati per comprendere il ruolo centrale della risposta immunitaria cellulare nel conferire una protezione incrociata all'infezione secondaria da SARS-CoV-2, indipendentemente dalla risposta umorale.

Background and aims. The recent generation of effective COVID-19 vaccines re-duced the morbidity and mortality caused by SARS-CoV-2 infection. However, the emergence of new variants of concern (VOC) that can escape the neutralizing activity of viral specific antibodies threatens their efficacy. For this reason, a deep study on the immune determinants that confer a memory protection, not based solely on humoral immunity, but also on cellular immunity, is needed. To fill this gap, (I-II) we aimed to establish an improved SARS-CoV-2 infection system in preclinical models, closely mimicking viral tropism and COVID-19 symptoms. (III) Then, taking advantage of this novel system, we characterized a new minimally edited transgenic hybrid mouse/human ACE2 mouse model (hy-ACE2). (IV) In the end, we employed these new tools to study the antibody independent response against SARS-CoV-2 secondary infection. Materials and methods: (I-II) We infected commercially available K18-hACE2 transgenic mice, expressing human angiotensin-converting enzyme 2 under the cytokeratin 18 promoter, using our novel aerosol (AR) infection system and compared it to intranasal (IN) injection. We assessed SARS-CoV-2 replication in the central nervous system and respiratory airways and the development of respiratory symptoms. (III) Moreover, we exposed hy-ACE2 transgenic mice with AR-SARS-CoV-2 and examined consequent viral replication, clinical features, and antiviral immune responses. (IV) We employed DHLMP2a mice, lacking surface and circulating immunoglobulins, and crossed them with K18-hACE2 and hy-ACE2 mice to investigate antibody-independent responses to secondary SARS-CoV-2 infection. Results: (I-II) The IN-infection resulted in fatal encephalitis, which rarely occurs in COVID-19 patients, limiting the usefulness of this model. On the other hand, mice ex-posed to aerosolized SARS-COV-2 survive and developed memory immunological response overtime. Similar to IN-infected mice, AR-infected K18-hACE2 mice developed pulmonary disease and anosmia. Nevertheless, SARS-CoV-2 AR exposure induced an increased viral-specific immune response and fibrin deposition in the lung. (III) Hy-ACE2 mice showed physiological level of ACE2 expression while sustaining SARS-CoV-2 replication in vivo. Moreover, these mice developed pulmonary disease and viral-specific immune response. (IV) Both antibody-competent and deficient mice exposed to D614G/Delta SARS-CoV-2 variants or immunized intramuscularly with SARS-CoV-2 (Wuhan-Hu-1) nucleoside-modified mRNA-lipid nanoparticles (LNP) vaccine were protected upon heterologous infection with Omicron B1 SARS-CoV-2 variant. Moreover, both antibody-competent and deficient mice were protected by severe COVID-19 induced by high-dose of infection with the mouse-adapted SARS-CoV-2. Finally, by depleting in vivo CD4+ and/or CD8+ T cells, we observed a potential role of CD4+ T cells in the protection against heterologous SARS-CoV-2 re-challenge. Conclusion. Overall, these results underline (I-II) the development of a novel aero-sol-based system of SARS-CoV-2 infection that well-recapitulate COVID-19 clinical features and immune response in both K18-hACE2 transgenic mice and (III) our novel hybrid human/mouse ACE2 mouse models. (IV) These new tools were employed to understand the pivotal role of cellular immune response in conferring cross-protection upon SARS-CoV-2 secondary infection, independently on the humoral response.