Exploiting miRNA networks in tumor associated macrophages to boost tumor immunity

I vettori virali sono strumenti versatili ed efficienti per l'ingegnerizzazione genetica delle cellule eucariotiche. Tra questi, i vettori lentivirali pseudotipizzati con VSV-G (LV) sono stati ampiamente studiati per il loro esteso tropismo e la capacità di trasdurre in modo stabile cellule proliferanti e non proliferanti. In seguito all'iniezione endovenosa in primati non umani e topi, i LV trasducono numerose popolazioni cellulari, in particolare nella milza e nel fegato. Basandosi su questa osservazione, i LV somministrati sistemicamente possono essere sfruttati per potenziare l'espressione genica, eliminare geni di interesse e misurare l'attività dei microRNA (miRNA) nelle cellule fagocitiche targettate dai LV, consentendo così di studiare i circuiti genici attivi durante le condizioni fisiologiche e patologiche (ad esempio, il cancro). Abbiamo somministrato LV codificanti GFP a topi adulti e abbiamo utilizzato l'immunofluorescenza confocale e la citometria a flusso per identificare le popolazioni cellulari epatiche e spleniche trasdotte. Abbiamo eseguito un scRNAseq sulle cellule spleniche trasdotte e analizzato in dettaglio alcune popolazioni chiave tramite sequenziamento di mRNA e miRNA. Abbiamo iniettato topi con LV reporter per i miRNA al fine di inferire l'attività dei miRNA in vivo sia in condizioni di omeostasi che in presenza di metastasi epatiche. Infine, abbiamo sfruttato i LV per potenziare l'espressione di miRNA selezionati nelle cellule fagocitiche in vitro e in vivo nel contesto di metastasi epatiche da cancro colorettale. Abbiamo effettuato un'analisi trascrittomica delle cellule trasdotte e valutato l'impatto dell'espressione dei miRNA sulla crescita del tumore e sul fenotipo immunitario in due modelli murini di metastasi epatica. Abbiamo identificato diverse popolazioni cellulari spleniche trasdotte dai LV, tra cui sottopopolazioni distinte di macrofagi, cellule dendritiche e cellule B. Abbiamo inoltre individuato molteplici miRNA differenzialmente espressi che sembrano essere lineage o popolazione specifici, confermando la loro funzione nel differenziamento e nell'attività delle cellule mieloidi. Infine, abbiamo indagato l'attività biologica di miRNA selezionati in vitro e in vivo, e abbiamo scoperto che l'induzione dell'espressione di miR-342 promuove l'attivazione immunitaria dei macrofagi, l'infiltrazione dei leucociti e una riprogrammazione generale del microambiente tumorale nelle metastasi epatiche, portando a un ritardo nella crescita del tumore. Nel complesso, il nostro lavoro descrive quali cellule fagocitiche sono trasdotte in modo efficiente mediante la somministrazione sistemica di LV nei topi, nonché diversi miRNA che consentono di sopprimere l'espressione di transgeni in diverse popolazioni off-target. Nel loro insieme, questi risultati potrebbero rivelarsi d'interesse per la progettazione di strategie di terapia genica "off-the-shelf" per il cancro o le malattie genetiche. Inoltre, abbiamo identificato un miRNA antitumorale che potrebbe essere sfruttato per potenziare l'immunità antitumorale in combinazione con le attuali immunoterapie contro il cancro.

Viral vectors are versatile and efficient tools for genetic engineering of eukaryotic cells. Among these, VSV-G-pseudotyped lentiviral vectors (LVs) have been extensively investigated for their broad tropism and capacity to stably transduce proliferating and non-proliferating cells. Upon intravenous injection in non-human primates and mice, LVs transduce numerous cell populations, especially in the spleen and the liver. Building on this observation, systemically delivered LVs can be exploited to enforce gene expression, knockout genes of interest and measure microRNA (miRNA) activity in LV-targeted phagocytic cells, thus allowing to investigate gene circuits active during physiological and pathological conditions (e.g. cancer). We delivered GFP-encoding LVs to adult mice and used immunofluorescence confocal imaging and flow cytometry to identify transduced hepatic and splenic cell populations. We performed a scRNAseq on transduced splenic cells, and analyzed key populations in depth by poly-A enriched and small RNA sequencing. We injected mice with miRNA reporter LVs to infer miRNA activity in vivo in both homeostasis and in presence of liver metastasis. Finally, we exploited LVs to enforce selected miRNA expression in phagocytic cells in vitro, and in vivo in a colorectal cancer liver metastasis setting. We performed a transcriptomic analysis of transduced cells, and evaluated miRNA expression impact on tumor growth and immune phenotype in two murine liver metastasis models. We identified different splenic cell populations transduced by LVs, including distinct subsets of macrophages, dendritic cells and B cells. We also found multiple differentially expressed miRNAs that seem to be either lineage or population specific, supporting their function in myeloid cell differentiation and function. Finally, we investigated the biological activity of selected miRNAs in vitro and in vivo, and found that enforcing miR-342 expression promoted immune activation of macrophages, leukocyte infiltration, and a general reprogramming of tumor microenvironment in liver metastasis leading to tumor growth delay. Overall, our work describes the phagocytic cells efficiently transduced upon systemic delivery of LVs in mice, as well as miRNAs that enable silencing of transgene products in off-target cells. Taken together these findings may be of interest for designing off-the-shelf gene-based therapeutic interventions for cancer or genetic diseases. Furthermore, we identified an antitumoral miRNA, which may be exploited to enhance anti-tumor immunity in combination with current cancer immunotherapy.