Development and validation of TCR-based immunotherapies for gastrointestinal tumors

Il tumore del colon-retto (CRC) e l’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) rappresentano ancora un’esigenza clinica non risolta, il cui alto tasso di mortalità dovuto all’insorgere di lesioni metastatiche, che limitano l’efficacia terapeutica dei trattamenti convenzionali. La terapia cellulare adottiva con linfociti T ingegnerizzati rappresenta una strategia terapeutica promettente per i pazienti con diagnosi avanzata, ma la sua applicabilità è ostacolata dalla mancanza di recettori delle cellule T (TCRs) che riconoscono antigeni rilevanti per il tumore e dalla presenza di un microambiente tumorale immunosoppressivo. In aggiunta, la sicurezza dei prodotti cellulari terapeutici generati attraverso strumenti di modificazione genomica è fondamentale per una efficiente e rapida traslazione clinica. Con lo scopo di migliorare il profilo di sicurezza dei prodotti terapeutici cellulari basati su cellule T generati da procedure di modificazione del genoma, abbiamo valutato l’efficacia e la sicurezza di un cytosine base editor (CBE). Abbiamo distrutto il TCR endogeno per ridirezionare la specificità delle cellule T contro il tumore, e TIGIT, una molecola inibitoria chiave nei tumori gastrointestinali per aumentare la capacità dei linfociti T di contrastare l’immunosoppressione. Oltre all’efficacia di CBE nel distruggere tutti i siti bersaglio contemporaneamente, analizzando i siti off-target predetti e attraverso tecniche di sequenziamento degli esoni ad alta profondità abbiamo osservato una attività off-target sgRNA-dipendente e indipendente marginale. Inoltre, al contrario delle cellule trattate con CRISPR/Cas9, non abbiamo rilevato traslocazioni nelle cellule trattate con CBE. Per selezionare gli antigeni da colpire con i linfociti T ingegnerizzati abbiamo investigato datasets pubblicati e identificato 19 antigeni associati al tumore rilevanti. Attraverso un tracciamento clonale del repertorio TCR delle cellule T stimolate con cellule presentanti l’antigene caricate con gli antigeni selezionati, abbiamo isolato 5 diversi TCRs specifici per AGR2, DKK1, ME, MSLN e MUC5AC. Di particolare rilevanza è che questi antigeni sono espressi dalla nostra coorte di pazienti CRC e PDAC sia con tumore primario che con metastasi al fegato. Abbiamo generato cellule T modificate per esprimere i TCR anti-tumorali e osservato che riescono ad eliminare linee cellulari di PDAC, organoidi di paziente di CRC e PDAC, mentre non riconoscono i controlli che non esprimono l’antigene o l’HLA corretto. Nonostante tutti i TCRs hanno mostrato una attività di uccisione del tumore comparabile tra loro, i TCRs specifici per AGR2, DKK1 e MSLN sono stati prioritizzati per la loro capacità di produrre citochine quando incontrano l’antigene. Per aumentare l’efficacia anti-tumorale delle cellule T abbiamo accoppiato alla modifica del TCR anche le distruzione di TIGIT. Abbiamo testato queste cellule in vitro e usando un modello ortotopico di metastasi al fegato di CRC, e osservato che l’assenza di TIGIT migliora l’abilità dei linfociti T di controllare la crescita del tumore in base a che TCR tumore-specifico viene espresso dalla cellula. I nostri risultati suggeriscono che CBE può essere utilizzato per generare in maniera efficiente linfociti T geneticamente modificati con un ottimo profilo di sicurezza. Inoltre abbiamo trovato che la distruzione di TIGIT ha il potenziale per aumentare l’efficacia anti-tumorale dei linfociti T con TCR tumore specifico, per il trattamento dei tumori gastrointestinali.

Colorectal cancer (CRC) and pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) are major unmet medical needs, with a high mortality rate mainly related to the onset of metastases, hindering the therapeutic efficacy of conventional treatments. Adoptive Cell Therapy (ACT) with TCR-edited T cells is a promising therapeutic strategy for patients with late-stage tumors, but its applicability is limited by the paucity of TCRs targeting relevant tumor antigens and the presence of an immunosuppressive tumor microenvironment. Moreover, the safety of the therapeutic cellular products, generated by genome editing tools, is fundamental for an effective and rapid clinical translation. With the aim of improving the safety profile of T-cell based therapeutic products manufactured by genome editing, we evaluated the efficacy and safety of cytosine base editor (CBE). We disrupted the endogenous TCR to redirect T cells specificity toward tumor cells, and TIGIT, a major inhibitory molecule in gastrointestinal tumors to enhancing T cell ability to counteract immunosuppression. Beyond the high efficiency of CBE in simultaneously disrupting the target genes, we observed only marginal sgRNA-dependent and -independent off-target events as measured by analyzing the top predicted off-target loci and by ultra-deep whole exome sequencing, respectively. In addition, unlike CRISPR/Cas9-treated cells, we could not detect translocations in CBE edited T cells. To select the antigens to target by engineered T cells, we investigated published datasets and identified 19 relevant tumor-associated antigens. By clonal tracking of the TCR repertoire of T cells stimulated with autologous APCs loaded with the selected antigens, we isolated 5 different TCRs specific for AGR2, DKK1, MET, MSLN and MUC5AC. Importantly, these antigens are expressed in our cohort of primary and metastatic PDAC and CRC patients. We generated TCR-edited T cells displaying anti-tumor activity against PDAC cell lines, CRC and PDAC patient-derived organoids and sparing HLA-unrelated and antigen-negative controls. Although all TCRs showed a comparable tumor killing ability, AGR2-, DKK1- and MSLN-T cells were prioritized for their ability to produce cytokines upon antigen recognition. To boost the efficacy of anti-tumor T cells, we coupled TIGIT disruption to TCR editing. By challenging TCR-edited TIGITKO T cells in vitro and in an orthotopic model of CRC liver metastases, we observed that TIGIT disruption can ameliorate the ability of tumor-specific T cells to control tumor growth, based on the anti-tumor TCR expressed by T cells. Our findings suggest that CBE can be exploited to efficiently generate genetically engineered T cell products with an optimal safety profile. Moreover, we found that TIGIT knockout has the potential to improve the anti-tumor efficacy of TCR-edited T cells for gastrointestinal tumors.