UNCOVERING UPSIDES AND PITFALLS OF CAS, BASE AND PRIME EDITING IN HEMATOPOIETIC STEM/PROGENITOR CELLS

La modifica genetica o gene editing delle cellule staminali ematopoietiche e delle cellule progenitrici (HSPC) offre grandi promesse per il trattamento delle malattie ereditarie attraverso l'ingegneria genetica precisa. Base e prime editing possono fornire un'ingegneria genetica più sicura e precisa rispetto agli approcci basati su nucleasi, evitando la dipendenza dalla rottura del doppio filamento del DNA (DSB). Tuttavia, questi sistemi sono limitati nella correzione di singole mutazioni puntiformi e/o nell'introduzione di modifiche di breve sequenza. Al contrario, la modifica basata su nucleasi che sfrutta la riparazione diretta dell'omologia (HDR) rimane il trattamento di scelta quando si mira all'integrazione mirata di sequenze di DNA terapeutico di grandi dimensioni. Nonostante siano stati riportati risultati promettenti riguardo al base e prime editing nelle HSPC, si sa poco riguardo alle risposte avverse e alla genotossicità a livello del genoma. Qui, abbiamo effettuato una valutazione comparativa confrontando gli editori base (BE) e il prime editor (PE) rispetto alla nucleasi Cas9 per la modifica nelle HSPC. Parallelamente, abbiamo sviluppato strategie per arricchire le HSPC modificate mediante HDR e raggiungere un'alta proporzione di cellule che portano la modifica desiderata nel prodotto cellulare infuso. La selezione mediante il Trasattivatore Artificiale (SMArT) ha permesso con successo di arricchire le HSPC modificate mediante HDR e di eliminare le HSPC che portavano sottoprodotti indesiderati e potenzialmente genotossici derivanti dalla rottura del DNA a bersaglio desiderato.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) gene editing holds great promise for the treatment of inherited diseases by precise genetic engineering. Base and prime editing may provide safer and more precise genetic engineering as compared to nuclease-based approaches bypassing the dependence on DNA double strand breaks (DSBs). However, these systems are limited to correct single point mutations and/or introduce short sequence edits. Conversely, nuclease-based editing leveraging on homology directed repair (HDR) remains the treatment of choice when aiming to targeted integration of large, therapeutic DNA sequences. Despite promising results having been reported for base and prime editing in HSPC, little is known about adverse responses, on-target and genome-wide genotoxicity. Here, we performed a comparative side-by-side assessment of base editors (BE) and prime editor (PE) versus Cas9 nuclease for editing in HSPCs. In parallel, we developed strategies to enrich for HDR-edited HSPCs and reach high proportion of cells bearing the intended edit in the infused cell product. Selection by Means of Artificial Transactivator (SMArT) successfully enriched for HDR-edited HSPCs and purged out HSPCs bearing undesired, and potentially genotoxic, on-target DNA DSB byproducts.