MOBILIZATION-BASED CHEMOTHERAPY-FREE ENGRAFTMENT OF GENE EDITED HEMATOPOIETIC STEM CELLS

Nell'attuale terapia genica con cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), le HSPC vengono mobilizzate, corrette geneticamente ex vivo e infuse dopo un regime di condizionamento mieloablativo volto a fare spazio al midollo osseo (BM). Tuttavia, gli approcci di condizionamento basati su chemio/radioterapia utilizzati in clinica possono portare a gravi effetti collaterali acuti e a lungo termine. Al fine di sviluppare un protocollo di condizionamento più sicuro e non genotossico, abbiamo dimostrato che la mobilizzazione delle HSPC crea un'opportunità per l'innesto continuo di cellule esogene, che possono competere efficacemente con le cellule mobilizzate nel ripopolare il midollo osseo ormai privo di HSPC. Inoltre, abbiamo dimostrato che la sovraespressione temporanea del recettore di homing CXCR4, utilizzando mRNA sintetici ottenuti tramite trascrizione in vitro, conferisce un vantaggio competitivo alle cellule trapiantate, facilitandone l’attecchimento. In questo studio, dimostriamo l'efficacia terapeutica in un modello murino di sindrome da HIGM-1 e in un topo ematochimerico umanizzato, dimostrando la sua applicabilità e versatilità abbinata a strategie di trasferimento genico ed editing genetico. Inoltre, il trapianto di HSPC che sovraesprimono transitoriamente una variante di CXCR4 resistente ai farmaci utilizzati per la mobilizzazione in topi ematochimici ha determinato un aumento dell'innesto rispetto alla sovraespressione del CXCR4 wild type. Tuttavia, pur essendo informativo, il modello murino ematochimerico potrebbe non replicare completamente l'interazione tra HSPC e BM umano. Pertanto, ulteriori test e convalide della nostra strategia di scambio in primati non umani (NHP) sono essenziali prima di considerarne la traslazione clinica. I risultati preliminari nel modello NHP si allineano con le osservazioni fatte nelle cellule umane, indicando che l'espressione di CXCR4 può essere ripristinata durante la coltura ex vivo di HSPC raccolte mediante mobilizzazione con G-CSF e AMD3100. Inoltre, la sovraespressione transiente di CXCR4 in queste cellule aumenta la loro efficienza migratoria in saggi di migrazione in vitro. Infine, abbiamo dimostrato come il base editing del locus CD33, di interesse clinico, e la sovraespressione di CXCR4 possono essere combinati senza compromettere l'efficienza di ciascuna procedura, fornendo alle cellule modificate un vantaggio migratorio. Nel complesso, i nostri risultati forniscono la prova di principio di una strategia trasformativa che apre la strada a un uso più ampio e sicuro della terapia genica delle HSPC.

In current hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) gene therapy, HSPCs are mobilized, genetically corrected ex vivo, and infused following myeloablative conditioning meant to make space the bone marrow (BM). However, the chemo/radiotherapy-based conditioning approaches used in the clinic can lead to severe acute and long-term side effects. To address this challenge and move towards a safer, non-genotoxic conditioning regimen, we demonstrate that HSPC mobilization creates an opportunity for seamless engraftment of exogenous cells, which can effectively compete with the mobilized cells in repopulating the depleted BM. Moreover, we show that transient overexpression of the CXCR4 homing receptor, using an optimized mRNA platform, confers a competitive engraftment advantage to the transplanted cells. In this study, we show the therapeutic efficacy in a mouse model of Hyper IgM Syndrome and in a human hematochimeric mice, showing its applicability and versatility when coupled to gene transfer and editing strategies. Additionally, transplantation of HSPCs transiently overexpressing a mobilizer-resistant CXCR4 variant in hematochimeric mice resulted in enhanced engraftment when compared to overexpression of the wild type CXCR4. While being informative, the hematochimeric mouse model may not fully replicate the human HSPC-niche interaction. Therefore, further testing and validation of our exchange strategy in non-human primates (NHPs) are essential before considering its clinical translation. Preliminary results in the NHP model align with the observations made in human cells, indicating that CXCR4 expression can be restored during ex vivo culture of NHP HSPCs harvested by G-CSF and AMD3100- mediated mobilization. Moreover, transient overexpression of CXCR4 in these cells increases their migration efficiency in in vitro migration assays. Additionally, we demonstrated that base editing at the CD33 locus and CXCR4 overexpression can be combined without compromising the efficiency of each procedure, providing edited cells with a migration advantage. Overall, our findings provide proof-of-principle of a transformative strategy paving the way to broader and safer use of HSPC gene therapy.