CARATTERIZZAZIONE DELL'INTERPLAY DINAMICO TRA p53 E NF-kB E LE SUE CONSEGUENZE SULLA RISPOSTA DELLE CELLULE DEL CANCRO AGLI STIMOLI GENOTOSSICI

Transcription factors (TFs) play a pivotal role in orchestrating the cellular response to various environmental stresses. These specialized proteins can activate or inhibit the expression of specific genes, enabling cells to adapt and survive in challenging conditions. p53 and NF-KB are two key TFs that mediate cell life/death decisions with opposite roles in cancer: p53 acts as a tumour suppressor, regulating cell fate after genotoxic stress, while NF-KB promotes inflammation, survival, and chemo-resistance. Different works show that these two TFs influence each other, and this crosstalk has been previously described in different cellular processes and phenotypes, but its precise mechanism remains unclear. Moreover, both TFs display a dynamic behaviour, key in regulating transcriptional programs and cell fate. The potential temporal dimension in their crosstalk remains largely unexplored, thus limiting our ability to reproduce an in vivo cancer scenario where both pathways are activated dynamically. In this work, we studied how p53 and NF-KB dynamics affect each other in breast cancer cells using molecular biology techniques and live-cell microscopy. Our results support the idea of a “dynamic crosstalk” between p53 and NF-KB. We found that triggering NF-KB with pro-inflammatory cytokines perturbs both p53 oscillations after DNA damage and progressive nuclear accumulation after Nutlin treatment, leading to higher p53 levels in both cases. This perturbation is abolished if we knock-out NF-KB’s key monomer p65 and is functional, since p53 target genes are transcribed more upon NF-KB co-activation. A combination of smFISH experiments and mathematical modelling suggest that the perturbation of p53 dynamics is caused by NF-KB-mediated upregulation of the TP53 gene. This perturbation impinges DNA damage repair efficiency: while p53 oscillations are capable of resolving DNA damage, its NF-KB-perturbed oscillations are less efficient, thus leading to a prolonged state of DNA injury. Our characterization highlights the relevance of studying the crosstalk of transcriptional pathways from a dynamic perspective. It provides novel insights on how these two TFs mutually influence each other, and in particular, chemotherapeutic treatments and tumour micro-environmental cues can co-participate in cancer cell fate decisions.

I fattori di trascrizione (TF) svolgono un ruolo fondamentale nell'orchestrare la risposta cellulare a vari stress ambientali. Queste proteine possono attivare o inibire l'espressione di geni specifici, consentendo alle cellule di adattarsi e sopravvivere in condizioni difficili. p53 e NF-kB sono due importanti TF che mediano le decisioni di vita/morte delle cellule con ruoli opposti nel cancro: p53 agisce come soppressore tumorale, regolando il destino delle cellule dopo lo stress genotossico, mentre NF-kB promuove l'infiammazione, la sopravvivenza e la chemio-resistenza. Diversi lavori dimostrano che questi due TF si influenzano reciprocamente e questo crosstalk è stato precedentemente descritto in diversi processi e fenotipi cellulari, ma il suo meccanismo preciso rimane poco chiaro. Inoltre, entrambi i TF mostrano un comportamento dinamico, fondamentale nella regolazione dei programmi trascrizionali e del destino cellulare. La potenziale dimensione temporale del loro crosstalk rimane in gran parte inesplorata, limitando così la nostra capacità di riprodurre uno scenario oncologico in vivo in cui entrambi loro pathway sono attivati dinamicamente. In questo lavoro abbiamo studiato come le dinamiche di p53 e NF-kB si influenzino reciprocamente nelle cellule di cancro al seno utilizzando tecniche di biologia molecolare e microscopia su cellule vive. I nostri risultati supportano l'idea di un "crosstalk dinamico" tra p53 e NF-kB. Abbiamo scoperto che l'attivazione di NF-KB con citochine pro-infiammatorie perturba sia le oscillazioni di p53 dopo un danno al DNA sia il progressivo accumulo nucleare dopo il trattamento con Nutlina, portando in entrambi i casi a un aumento dei livelli di p53. Questa perturbazione è abolita se si elimina il monomero chiave p65 di NF-KB ed è funzionale, poiché i geni bersaglio di p53 sono trascritti maggiormente quando NF-kB è co-attivato. Una combinazione di esperimenti smFISH e di modellizzazione matematica suggerisce che la perturbazione della dinamica di p53 è causata dall'up-regolazione del gene TP53 mediata da NF-KB. Questa perturbazione influisce sull'efficienza della riparazione del danno al DNA: mentre le oscillazioni di p53 sono in grado di risolvere il danno, le sue oscillazioni, se perturbate da NF-KB, sono meno efficienti, portando così a uno stato cronico di danno al DNA. La nostra caratterizzazione evidenzia l'importanza di studiare il crosstalk dei percorsi trascrizionali da una prospettiva dinamica e fornisce nuove intuizioni su come queste due TF si influenzano reciprocamente e, in particolare, i trattamenti chemioterapici e i fattori del microambiente tumorale possono co-partecipare alle decisioni sul destino delle cellule tumorali.