The inhibition of the HMGB1/CXCL12/CXCR4 axis in inflammation-related cancers: a structural and functional study

BACKGROUND: Negli ultimi dieci anni, gli studi nel campo della biologia delle chemochine hanno rivelato una notevole complessità dell'interattoma delle chemochine. La scoperta degli eteromeri delle chemochine e della loro capacità di potenziare o smorzare le risposte funzionali dei loro recettori cognati ha portato a nuove opportunità terapeutiche per manipolare il sistema delle chemochine in modo sofisticato. La chemochina CXCL12 forma con l'alarmina HMGB1 completamente ridotta (fr) un eterocomplesso fisiologicamente rilevante (CXCL12°frHMGB1) che promuove sinergicamente la risposta infiammatoria provocata dal recettore accoppiato alla proteina G CXCR4. Il sinergismo funzionale dell'eterocomplesso è stato collegato a malattie infiammatorie, in particolare artrite reumatoide, e a tumori correlati all'infiammazione, come il mesotelioma maligno. Pertanto, mirare a CXCL12°frHMGB1 per trattare disturbi infiammatori e possibilmente il cancro, smorzando l'iperattività di CXCR4 e il mantenimento in superficie, potrebbe essere una strategia terapeutica promettente. Tuttavia, i dettagli molecolari dell'eterocomplessazione erano ancora sfuggenti, poiché mancava l'informazione di una struttura validata sperimentalmente. Inoltre, HMGB1 appartiene alla classe delle proteine intrinsecamente disordinate che mostrano un elevato grado di flessibilità, le cui interazioni e modalità di legame sono difficili da prevedere con gli attuali strumenti di intelligenza artificiale. OBIETTIVO: Lo scopo di questo lavoro è quindi ottenere un modello a risoluzione atomica validato sperimentalmente di CXCL12°frHMGB1 in soluzione. RISULTATI: Mostriamo attraverso un approccio strutturale integrato (NMR, ITC, MST, AUC, SAXS) che CXCL12 e frHMGB1 formano un insieme di eterocomplessi dinamici interconvertibili e riveliamo siti di legame biologicamente rilevanti di CXCL12°frHMGB1. Qui, scopriamo un ruolo inaspettato della regione acida intrinsecamente disordinata (IDR) di HMGB1 nella formazione del complesso con CXCL12 e inoltre nel legame a CXCR4 sulla superficie cellulare. L'interfaccia di legame eteromerica coinvolge sia i domini tandem HMG che l'IDR acida di frHMGB1 nel riconoscimento della superficie di dimerizzazione di CXCL12. È importante notare che l'IDR acida di HMGB1 rimane strutturalmente disordinata nel complesso stabilendo contatti dinamici tra i domini strutturati di HMGB1, il linker e CXCL12. Il risultato di questo interplay dinamico è che CXCL12$\bullet$frHMGB1 non può essere rappresentato da una singola struttura ma da un insieme di eterocomplessi. A differenza delle precedenti ipotesi, abbiamo dimostrato sperimentalmente che una molecola di CXCL12 si lega a frHMGB1 in un rapporto 1:1 e che CXCL12 è in grado di discriminare lo stato redox di HMGB1 legandosi preferenzialmente a BoxA di frHMGB1. Come molte interazioni tra chemochine, la costante di dissociazione dell'eteroassociazione è nell'intervallo dei bassi micromoli e principalmente guidata dalla carica, con l'IDR acida che recluta CXCL12 tramite interazioni elettrostatiche a lungo raggio favorendo così il processo di riconoscimento. CONCLUSIONE: Su questa base, CXCL12°frHMGB1 è un complesso proteico fuzzy, che per definizione è un insieme di complessi che si formano a causa del mantenimento del disordine strutturale delle regioni flessibili. L'interazione CXCL12-HMGB1 si discosta dalla classica dimerizzazione rigida delle chemochine eterofiliche. L'inibizione farmacologica dei siti di interazione fuzzy di CXCL12°frHMGB1 potrebbe aprire la strada per il trattamento contro condizioni infiammatorie e neoplasie.

BACKGROUND: Over the last decade, studies in the chemokine biology field revealed remarkable complexity of the chemokine interactome. The discovery of chemokine heteromers and their ability to enhance or dampen the functional responses of their cognate receptors led to new therapeutic opportunities to manipulate the chemokine system in a sophisticated manner. Chemokine CXCL12 forms with fully reduced (fr) alarmin HMGB1 a physiologically relevant heterocomplex (CXCL12°frHMGB1) that synergically promotes the inflammatory response elicited by the G-protein coupled receptor CXCR4. The functional synergism of the heterocomplex has been linked to inflammatory diseases, in particular rheumatoid arthritis, and to inflammation-related cancers, such as malignant mesothelioma. Targeting therefore CXCL12°frHMGB1 to treat inflammatory disorders and possibly cancer by dampening CXCR4 hyperactivity and surface retention might be a promising therapeutic strategy. However, the molecular details of heterocomplexation were still elusive, as they lack the information of an experimentally validated structure. Moreover, HMGB1 belongs to the class of intrinsically disordered proteins displaying a high degree of flexibility, whose interaction sites and binding modes are difficult to predict by current artificial intelligence tools. AIM: The aim of this work is therefore to obtain an experimentally validated atomic-resolution model of CXCL12°frHMGB1 in solution RESULTS: We show by an integrated structural approach (NMR, ITC, MST, AUC, SAXS) that CXCL12 and frHMGB1 form an ensemble of dynamic interconvertible heterocomplexes and unravel biologically relevant binding sites of CXCL12°frHMGB1. Herein, we uncover an unexpected role of the acidic intrinsically disordered region (IDR) of HMGB1 in complex formation with CXCL12 and furthermore in binding to CXCR4 on the cell surface. The heteromeric binding interface involves both the HMG tandem domains and acidic IDR of frHMGB1 in recognizing the dimerization surface of CXCL12. Importantly, the acidic IDR of HMGB1 remains structurally disordered in complex establishing dynamic contacts between HMGB1’s structured domains, linker and CXCL12. The result of this dynamic interplay is that CXCL12$\bullet$frHMGB1 cannot be represented by a single structure but by an ensemble of heterocomplexes. Unlike previous assumptions, we demonstrated experimentally that one CXCL12 molecule binds to frHMGB1 in a 1:1 ratio and that CXCL12 is able to discriminate the redox state of HMGB1 by binding preferentially to BoxA of frHMGB1. Like many chemokine interactions, the dissociation constant of hetero-association is in the low-micromolar range and mainly charge-driven with the acidic IDR recruiting CXCL12 via long-range electrostatic interactions favouring thereby the recognition process. CONCLUSION: On this basis, CXCL12°frHMGB1 is a fuzzy protein complex, which by definition is an ensemble of complexes that are formed due to retained structural disorder of flexible regions. The CXCL12-HMGB1 interaction diverges from the classical rigid heterophilic chemokines dimerization. Pharmacological inhibition of fuzzy interaction sites of CXCL12°frHMGB1 may pave the way for the treatment against inflammatory conditions and malignancies.