ROLE OF THE ENDOSOMAL TRAFFICKING IN RNA CONTROL OF AUTOPHAGY IN NEURONS

La localizzazione dell'RNA è particolarmente importante in cellule morfologicamente complesse come i neuroni, dove un'espressione proteica precisa è necessaria per ottenere funzioni altamente compartimentalizzate. Evidenze emergenti suggeriscono che il traffico endosomale potrebbe essere direttamente coinvolto nella localizzazione e traduzione dell'RNA nei neuroni. Tuttavia, l'identità degli mRNA regolati dagli endosomi e il ruolo funzionale degli endosomi nel controllo della sintesi proteica subcellulare devono ancora essere compresi. Combinando un approccio di marcatura prossimale e il sequenziamento dell'RNA in cellule SH-SY5Y, riportiamo qui la presenza di un ricco repertorio di mRNA associati alle membrane dei RAB5-endosomi. Tra questi trascritti, abbiamo identificato mRNA codificanti per proteine correlate a molteplici compartimenti subcellulari, inclusi vari organelli. Inoltre, abbiamo osservato un arricchimento di mRNA che codificano per proteine correlate all'autofagia. Abbiamo ulteriormente validato queste associazioni tramite ibridazione in situ e traslocazione subcellulare degli endosomi precoci (EE) positivi per RAB5 nelle cellule SH-SY5Y. Utilizzando le cellule gangliari retiniche (RGC) di Xenopus, abbiamo scoperto che mRNA correlati all'autofagia, inclusi i trascritti di map1lc3b, sono presenti e tradotti negli assoni, dove si associano anche con gli endosomi. Abbiamo dimostrato che la localizzazione assonale degli mRNA di map1lc3b, ma non quella endosomale, dipende dal 3'UTR e abbiamo identificato le proteine leganti l'RNA associate a map1lc3b. Successivamente, abbiamo scoperto che i Rab5-EE che trasportano l'mRNA di map1lc3b accumulano Lc3b sulle loro membrane, un processo ulteriormente aumentato in condizioni di stress endosomale. Inoltre, l'inibizione della sintesi proteica riduce significativamente la localizzazione di marcatori autofagici sui Rab5-endosomi. Bloccando l'autofagia, abbiamo osservato un accumulo di endosomi anormali negli assoni, suggerendo un ruolo chiave di questo processo nel mantenimento dell'omeostasi endosomale a livello subcellulare. Infine, abbiamo mostrato che anche condizioni di stress specifiche per gli endosomi tardivi e i mitocondri inducono il reclutamento dell'mRNA di map1lc3b sugli organelli danneggiati nelle cellule SH-SY5Y, suggerendo che questa regolazione potrebbe non limitarsi agli endosomi precoci. Complessivamente, i nostri risultati supportano un nuovo ruolo per la localizzazione e la traduzione dell'RNA nell'autofagia degli endosomi danneggiati negli assoni.

RNA localization is particularly important in morphologically complex cells such as neurons, where precise protein expression is necessary to achieve highly compartmentalized functions. Emerging evidence suggests that endosomal trafficking could be directly involved in RNA localization and translation in neurons. However, the identity of endosomal-regulated mRNAs, and the functional role of endosomes in controlling subcellular protein synthesis, remain to be understood. By coupling proximity labeling and RNA sequencing in SH-SY5Y cells, we here report the presence of a rich repertoire of mRNAs associated with RAB5-endosomal membranes. Among these transcripts, we found mRNAs encoding for proteins related to multiple subcellular compartments, including various organelles. Interestingly, we observed an enrichment for mRNAs encoding for autophagy-related proteins. We further validated these associations by in situ hybridization and subcellular translocation of RAB5-positive early endosomes (EEs) in SH-SY5Y cells. Using Xenopus retinal ganglion cells (RGCs), we found that autophagy-related mRNAs, including map1lc3b transcripts, are present and translated in axons, where they also associate with endosomes. We showed that map1lc3b mRNA axonal localization, but not endosomal localization, is dependent on its 3’UTR and we identified map1lc3b-associated RNA-binding proteins. We then found that Rab5-EEs carrying map1lc3b mRNA accumulate Lc3b on their membranes, a process which was further increased by endosomal stress conditions. Moreover, inhibition of protein synthesis significantly reduces the localization of autophagy markers to Rab5- endosomes. By preventing autophagy, we observed an accumulation of aberrant endosomes in axons, suggesting a key role for this process in maintaining subcellular endosomal homeostasis. Finally, we showed that also late endosome- and mitochondria-specific stress induced map1lc3b mRNA recruitment on damaged organelles in SH-SY5Y cells, suggesting that this regulation could extend beyond early endosomes. Altogether, our findings support a new role for RNA localization and translation in the autophagy of damaged endosomes in axons.