Role of adenosine deaminase 2 in hematopoiesis regulation

Deficiency of adenosine deaminase 2 (DADA2) is a rare autosomal recessive disorder characterized by systemic inflammation, immune dysregulation, and bone marrow (BM) failure. Although anti-TNF therapy controls vasculitis, it does not restore hematopoiesis or prevent progression to BM failure. This therapeutic gap highlights a central unresolved question: how does ADA2 loss disrupt hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) function and compromise the hematopoietic system? This thesis addresses this question by characterizing patient-derived HSPCs and the BM niche—still poorly defined in DADA2—and then dissecting the cell-intrinsic consequences of ADA2 loss while evaluating lentiviral ADA2 gene transfer as a corrective strategy. Immunophenotypic and transcriptomic profiling of patient BM revealed a profound depletion of CD34⁺ HSPCs with impaired clonogenic and engraftment potential, accompanied by strong induction of immediate-early gene programs and loss of HSC quiescence. Single-cell RNA sequencing identified extensive transcriptional rewiring, including enrichment of TNF-NF-B and TGF-β signaling, metabolic changes such as increased glucose uptake signature, and disrupted niche-sensing pathways. An shRNA-mediated ADA2 knockdown model in healthy HSPCs demonstrated that ADA2 loss alone impairs proliferation, colony formation, and in vivo engraftment, and induces intrinsic upregulation of TGF-β receptors. Pharmacological inhibition of this pathway—via Fresolimumab (anti-TGF-β antibody) or SMAD inhibition—rescued clonogenic potential, indicating that TGF-β hyperactivation in a key driver of HSPC dysfunction. Parallel studies of patient-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) showed reduced proliferation, early senescence, and accumulation of DNA damage foci, implicating stromal dysfunction as an additional contributor of hematopoietic impairment. To test therapeutic correction, a clinically relevant lentiviral vector (LV.ADA2) was used to reconstitute ADA2 express

Il deficit di adenosina deaminasi 2 (DADA2) è una rara malattia autosomica recessiva caratterizzata da infiammazione sistemica, disregolazione immunitaria e insufficienza midollare. Sebbene la terapia anti-TNF controlli la vasculite, non ripristina l’ematopoiesi, né previene la progressione verso l’insufficienza midollare, lasciando irrisolto come la perdita di ADA2 comprometta la funzione delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC). Questa tesi caratterizza le HSPC dei pazienti e la nicchia midollare, ancora poco definite nella DADA2, e analizza le conseguenze cellulo-intrinseche della perdita di ADA2, valutando in parallelo il trasferimento genico lentivirale come potenziale strategia correttiva. Analisi immunofenotipiche e trascrittomiche del midollo osseo di pazienti hanno rivelato una marcata deplezione delle HSPC, con ridotta capacità clonogenica ed engraftment. Questi difetti si associano all’induzione immediata di geni precoci e alla perdita della quiescenza delle HSC. Inoltre, l’analisi di sequenziamento scRNA ha evidenziato un’estesa riorganizzazione trascrizionale, inclusi arricchimento delle vie TNF–NF-κB e TGF-β, modificazioni metaboliche e alterazioni dei programmi si segnalazione della nicchia. Un modello di knockdown di ADA2 tramite shRNA in HSPC sane ha confermato che la perdita di ADA2 è sufficiente a ridurre proliferazione, formazione di colonie e attecchimento, inducendo una una regolazione intrinseca dei recettori del TGF-β. L’inibizione farmacologica della via ha ripristinato la capacità clonogenica, evidenziando un ruolo dell’iperattivazione del TGF-β nella disfunzione delle HSPC. Parallelamente, le cellule stromali mesenchimali (MSC) derivate dai pazienti hanno mostrato ridotta proliferazione, senescenza precoce e accumulo di danno al DNA, indicando un contributo aggiuntivo della nicchia al difetto ematopoietico. Per valutare la correzione terapeutica, è stato utilizzato un vettore lentivirale (LV.ADA2) per ripristinare ADA2 nelle HSPC di pazienti. Le cellule corrette hanno recuperato espressione e attività enzimatica di ADA2, mantenuto capacità clonogenica e differenziativa e ottenuto un attecchimento multi-lignaggio stabile nei topi NSGW41. L’analisi dei siti di integrazione ha confermato una ricostituzione policlonale e genomicamente sicura. Nel complesso, questi risultati definiscono la DADA2 come una malattia che coinvolge sia difetti intrinseci delle HSPC sia alterazioni della nicchia midollare, chiariscono i meccanismi dell’insufficienza midollare e supportano lo sviluppo di una terapia genica autologa.