Proliferative stress and DNA damage response pathways in hematopoietic stem cell gene therapy and clonal hematopoiesis

L’editing genomico (GE) delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) rappresenta una strategia terapeutica promettente, ma rimane limitato da rischi genotossici associati alla formazione di rotture a doppio filamento del DNA, all’impiego di vettori virali e allo stress proliferativo indotto durante la manipolazione ex vivo. La coltura ex vivo è indispensabile per ottenere un’efficiente riparazione per ricombinazione omologa (HDR), ma causa stress cellulare e compromette la funzionalità delle HSPC. In questo lavoro, mostriamo che l’attivazione ex vivo innesca un asse p38 MAPK-ROS che promuove un rapido ingresso nel ciclo cellulare e l’accumulo di danno al DNA associato alla proliferazione. L’inibizione transitoria di p38 riduce lo stress ossidativo e il danno al DNA, preservando la funzionalità delle HSPC durante la coltura e il GE. In diversi contesti di editing, l’inibizione di p38 migliora la multipotenza, la capacità di ripopolamento e l’output clonale a lungo termine delle HSPC editate. Analisi di genotossicità, incluse la quantifica di delezioni on-target, le integrazioni aberranti del vettore AAV e il mapping delle traslocazioni mediante CAST-seq, non hanno evidenziato un aumento di varianti strutturali o eventi off-target. Inoltre, studi di xenotrapianto a lungo termine, seguiti da sequenziamento dell’esoma, supportano il mantenimento della stabilità genomica nelle HSPC editate dopo l’inibizione di p38. Parallelamente, abbiamo investigato l’impatto funzionale di mutazioni associate all’ematopoiesi clonale (CH) in geni della risposta al danno del DNA (DDR). Utilizzando CRISPR/Cas9, abbiamo modellato mutazioni loss-of-function in ATM e CHEK2 e gain-of-function in PPM1D in HSPC umane. Le cellule mutanti per DDR mostrano un vantaggio competitivo, con maggiore proliferazione, capacità clonogenica e resistenza al danno indotto da etoposide. Queste mutazioni alterano la dinamica della segnalazione DDR, favorendo un recupero più rapido nonostante livelli comparabili di lesioni al DNA. Nel complesso, questo lavoro identifica lo stress proliferativo come determinante chiave della disfunzione delle HSPC durante la manipolazione ex vivo e dimostra che la modulazione delle vie di risposta allo stress può migliorarne sicurezza ed efficacia. Inoltre, evidenzia che mutazioni DDR associate alla CH possono riprogrammare sia la funzione delle cellule staminali sia quella delle cellule immunitarie, contribuendo alla comprensione dell’evoluzione della CH e delle sue implicazioni nella patologia e nella resistenza alle terapie.

Gene editing (GE) of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) holds significant therapeutic promise but remains constrained by genotoxic risks associated with DNA double-strand breaks, donor template delivery, and proliferation-induced stress during ex vivo manipulation. Ex vivo culture is indispensable to achieve efficient homology-directed repair (HDR), yet comes at the cost of inducing cellular stress and compromising HSPC fitness. Here, we identify p38 MAPK signaling as a central regulator of culture-induced stress in human HSPCs. Mechanistically, ex vivo activation triggers a p38 MAPK-ROS axis that promotes rapid cell cycle entry and proliferation-associated DNA damage. Transient pharmacological inhibition of p38 mitigates oxidative stress and DNA damage accumulation, thereby preserving HSPC functionality during ex vivo manipulation and GE. Across multiple editing targets, including AAVS1 and clinically relevant loci, p38 inhibition enhances multipotency, repopulating capacity, and long-term clonal output of gene-edited HSPCs. Comprehensive safety analyses, including quantification of large on-target deletions, AAV donor mis-integration, and CAST-seq mapping of chromosomal translocations, revealed no increase in structural variants or off-target events upon p38 inhibition. Long-term xenotransplantation followed by whole-exome sequencing further supports preserved genomic stability in edited HSPCs. In parallel, we investigated the functional impact of clonal hematopoiesis (CH)-associated mutations affecting DNA damage response (DDR) genes. Using CRISPR/Cas9, we modeled ATM and CHEK2 loss-of-function mutations and truncating PPM1D gain-of-function mutations in primary human HSPCs. DDR-mutant cells exhibited a consistent competitive fitness advantage, characterized by enhanced proliferation and clonogenic potential. Notably, these mutations conferred increased resistance to etoposide-induced damage and altered DDR signaling dynamics, promoting faster recovery despite comparable levels of DNA lesions. Collectively, this work identifies proliferative stress as a key determinant of HSPC dysfunction during ex vivo manipulation and establishes modulation of stress-response pathways as a strategy to improve the safety and efficacy of GE. In parallel, it provides functional evidence that CH-associated DDR mutations can reprogram both stem and immune cell function, advancing our understanding of CH evolution and its implications in disease and therapy resistance.