Studying immunometabolic alterations in age-related diseases

Il ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA) rappresenta una via metabolica cellulare fondamentale per la generazione di ATP mitocondriale e di intermedi anabolici. La succinato deidrogenasi (SDH), il complesso enzimatico che catalizza l'ossidazione del succinato a fumarato nel TCA, è il primo enzima mitocondriale identificato come mutato nel cancro. La perdita della funzione di SDH compromette il TCA e innesca l'accumulo di succinato nelle cellule tumorali. Tuttavia, le modalità con cui i tumori fronteggiano un TCA disfunzionale rimangono ampiamente non chiarite. Questa tesi affronta tale questione integrando approcci di chimica analitica, biologia cellulare e bioinformatica. Utilizzando cellule epiteliali renali murine immortalizzate delete per SDH, abbiamo dimostrato inizialmente che la deficienza di SDH costringe le cellule a dipendere dall'attività della glutammato-piruvato transaminasi mitocondriale (GPT2) per la proliferazione. Alimentando la carbossilazione riduttiva della glutammina, GPT2 sostiene un circuito metabolico che mantiene un pool intracellulare favorevole di NAD+, supportando così le richieste glicolitiche delle cellule SDH-deficienti. Di conseguenza, la perdita di SDH conferisce sensibilità alla deplezione di NAD+ tramite l'inibizione farmacologica della nicotinammide fosforibosiltransferasi (NAMPT), l'enzima limitante della via di salvataggio del NAD. Successivamente, impiegando una linea di carcinoma renale umano con inattivazione spontanea del complesso SDH, abbiamo dimostrato che la disfunzione di SDH compromette la sintesi de novo dei nucleotidi purinici, potenziando al contempo la via di salvataggio delle purine. Questa via è sostenuta principalmente dal consumo di nucleosidi dal terreno di coltura; il blocco farmacologico dei trasportatori dei nucleosidi inibisce la proliferazione delle cellule SDH-deficienti, risparmiando invece le cellule con SDH funzionale. Infine, abbiamo identificato una nuova vulnerabilità ferro-dipendente legata alla deficienza di SDH. Dimostriamo che la β-idrossibutirrato deidrogenasi 2 (BDH2) sostiene la proliferazione delle cellule SDH-deficienti regolando l'omeostasi intracellulare del ferro e limitando lo stress ossidativo ferro-dipendente. La deplezione di BDH2 innesca l'accumulo lisosomiale di ferro redox-attivo, un aumento dello stress ossidativo e la ferroptosi, processi che possono essere prevenuti da inibitori della ferroptosi e chelanti del ferro. I nostri dati suggeriscono inoltre che BDH2 protegga le cellule SDH-deficienti dalla ferroptosi indipendentemente dalla nota produzione del sideroforo acido 2,5-diidrossibenzoico (2,5-DHBA), indicando potenziali funzioni secondarie di BDH2 nell'omeostasi del ferro. In sintesi, questa tesi dimostra che la deficienza di SDH guida una riprogrammazione coordinata del metabolismo degli amminoacidi, dei nucleotidi, del potenziale redox e del ferro, esponendo così distinte vulnerabilità metaboliche. Questi adattamenti rivelano nuove interazioni sintetico-letali di natura metabolica e delineano potenziali strategie terapeutiche specificamente mirate ai tumori con mutazioni di SDH.

The tricarboxylic acid (TCA) cycle is a core metabolic pathway for the generation of mitochondrial ATP and key anabolic intermediates in cells. Succinate dehydrogenase (SDH), the enzymatic complex that catalyzes the oxidation of succinate to fumarate in the TCA cycle, stands as the first mitochondrial enzyme found mutated in cancer. Loss of SDH function disrupts the TCA cycle and triggers succinate accumulation in tumor cells. However, how tumors cope with a dysfunctional TCA cycle remains largely unsolved. This thesis addresses this question by integrating analytical chemistry, cell biology and bioinformatics‑based approaches. Using immortalized murine renal epithelial cells lacking SDH activity, we first demonstrated that SDH deficiency forces cells to rely on mitochondrial glutamate–pyruvate transaminase (GPT2) activity for proliferation. By driving reductive glutamine carboxylation, GPT2 fuels a metabolic circuit that maintains a favorable intracellular NAD⁺ pool, thereby supporting the glycolytic demands of SDH‑deficient cells. As a consequence, SDH deficiency confers sensitivity to NAD⁺ depletion via pharmacological inhibition of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT), the rate‑limiting enzyme of the NAD⁺ salvage pathway. Next, employing a human renal cell carcinoma line with spontaneous mutational inactivation of the SDH complex, we demonstrated that SDH dysfunction impairs de novo purine nucleotide synthesis while enhancing the purine salvage pathway. This pathway is primarily supported by nucleoside uptake from the culture medium, and pharmacological blockade of nucleoside transporters inhibits proliferation of SDH‑deficient cells while sparing SDH‑proficient counterparts. Finally, we identify a novel, iron‑dependent vulnerability linked to SDH deficiency. We demonstrate that β‑hydroxybutyrate dehydrogenase 2 (BDH2) sustains proliferation of SDH‑deficient cells by regulating intracellular iron homeostasis and limiting iron‑dependent oxidative stress. BDH2 depletion triggers lysosomal accumulation of redox‑active iron, increased oxidative stress and ferroptosis, which can be rescued by ferroptosis inhibitors and iron chelators. Importantly, our data also suggest that BDH2 protects SDH‑deficient cells from ferroptosis independently of the well‑established production of the mammalian siderophore 2,5‑dihydroxybenzoic acid (2,5‑DHBA), pointing to potential moonlighting roles of BDH2 in iron homeostasis. In summary, this thesis demonstrates that SDH deficiency drives a coordinated rewiring of amino acid, nucleotide, redox and iron metabolism, thereby exposing distinct metabolic liabilities. These adaptations highlight new metabolic synthetic‑lethal interactions and define potential therapeutic strategies specifically tailored for SDH‑mutated tumors.