Regolazione dell'espressione di CDKL5 e sua rilevanza nel CDKL5 Deficiency Disorder: nuove evidenze dell'efficienza traduzionale guidata dal 5'UTR

CDKL5 is a protein kinase with important functions, acting as transcriptional regulator in the nucleus, modulating the cell cycle and apoptosis, and sensing DNA damages. This kinase, enriched in neurons, is involved in the correct development of the neuronal networks, and has a fundamental role in shaping synapses. Therefore, it does not come as a surprise that a decrease in its expression leads to a severe neurodevelopmental condition known as CDKL5 Deficiency Disorder (CDD), a rare X-linked epileptic encephalopathy. Most of the causative mutations of the disorder were reported in the CDKL5 coding region, but the identification of a novel SNP within the CDKL5 transcript leader, described by Evans et al. in 2005, led us to consider that its 5’UTR could also play a role in maintaining the physiological protein level by modulating the translational efficiency of the transcript. Other proteins with analogous functions in neurons are regulated by a translational control through their 5’UTRs. Indeed, we found that the CDKL5 5’UTR respects the typical features of a functional, highly-structured 5’UTRs and shows an impressive conservation throughout evolution. In addition, we observed that the silencing of eIF4B, a translational eukaryotic initiation factor involved in the unwinding of structured 5’UTR, correlated with a strong decrease of CDKL5. We analyzed the CDKL5 5’UTR by bioinformatic tools and verified the functionality of the various 5’UTR variants through a Dual Luciferases Reporter Assay, supporting a role of CDKL5 5’UTR in the translational modulation of the protein expression through cap-dependent and IRES-mediated mechanisms. Moreover, we obtained the first experimental hint pointing to a possible pathogenic role of the SNP found by Evans. Finally, we quantified the TSS usage of different CDKL5 transcript variants based on CAGE libraries, to better understand the meaning of the numerous alternative first exons of CDKL5 and their usage in the human tissues. Our work is the first comprehensive study about the 5’UTR of CDKL5, and not only demonstrates the importance of 5’UTR in the modulation of CDKL5, but also potentially open new options for therapeutic strategies to treat CDD.

CDKL5 è una chinasi con funzioni importanti, che agisce come regolatore trascrizionale nel nucleo, modula il ciclo cellulare e l'apoptosi, e percepisce il danno al DNA. Questa chinasi, molto espressa nei neuroni, è coinvolta nel corretto sviluppo del network neuronale e ha un ruolo fondamentale nello sviluppo delle sinapsi. Dunque, non è sorprendente che una diminuzione nei suoi livelli porti ad una grave condizione del neurosviluppo conosciuta come CDKL5 Deficiency Disorder (CDD), una rara encefalopatia. Molte mutazioni causative della patologia sono riportate essere nella regione codificante di CDKL5, ma l'identificazione di una nuova SNP nel 5'UTR di CDKL5, descritta da Evans et al. nel 2005, ci ha portati a considerare che questo 5'UTR potrebbe giocare un ruolo nel mantenere i livelli fisiologici della proteina modulando l'efficienza traduzionale del trascritto. Altre proteine con funzioni analoghe nei neuroni sono regolate attraverso il controllo traduzionale mediato dal loro 5'UTR. Dunque, abbiamo trovato che il 5'UTR di CDKL5 rispecchia le caratteristiche tipiche dei 5'UTR funzionali altamente strutturati e mostra una conservazione interessante durante l'evoluzione della sua sequenza. In più, abbiamo osservato che silenziando l'espressione del fattore dell'inizio della traduzione eucariotico eIF4B (fattore coinvolto nel rilassamento dei 5'UTR strutturati), si osserva una forte diminuzione di CDKL5. Abbiamo analizzato il 5'UTR di CDKL5 attraverso analisi bioinformatiche per poi analizzare sperimentalmente la sua funzionalità attraverso il Dual Luciferases Reporter Assay, evidenziando il ruolo di questa sequenza nella modulazione traduzionale della proteina attraverso meccanismi cap-dipendenti ed IRES-mediati. Per di più, abbiamo ottenuto una prima evidenza sperimentale di un possibile ruolo patogenico della SNP trovata da Evans. Infine, abbiamo quantificato il TSS usage dei diversi trascritti di CDKL5 utilizzando librarie CAGE di tessuti umani. Il nostro lavoro è il primo studio incentrato sul 5'UTR di CDKL5, e non dimostra solamente l'importanza del 5'UTR nella modulazione della proteina prodotta, ma anche introduce anche la possibilità di poter sviluppare nuove strategie terapeutiche per trattare la CDD.